盧紹曾，吳劍榮，朱 莉，鄭志永，詹曉北

（江南大學 生物工程學院 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

聚乙二醇-聚唾液酸嵌段聚合修飾尿酸酶

盧紹曾，吳劍榮，朱 莉，鄭志永，詹曉北

（江南大學 生物工程學院 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

探索一種綜合聚唾液酸（PSA）和聚乙二醇（PEG）優(yōu)勢的蛋白修飾方法。對純化的聚唾液酸進行兩步活化，先在非還原端氧化產(chǎn)生活性醛基，再加入胱胺形成活性巰基；活化的聚唾液酸（相對分子質(zhì)量為3.4×104）和異基雙功能的PEG（相對分子質(zhì)量為3.5×103）形成嵌段聚合物，然后于4℃修飾尿酸酶。利用凝膠層析（Toyopearl HW-55F）對修飾后的尿酸酶進行純化，收集相應峰進行化學法和SDS-PAGE電泳鑒定，經(jīng)多角度激光光散射凝膠系統(tǒng)測定綴合物相對分子質(zhì)量為5.214×105；相對于原始酶，修飾酶酶活保留率72.4%，體外熱失活半衰期由115.5 h提高到231 h，對高溫、酸堿、胰蛋白酶的耐受穩(wěn)定性顯著提高。

聚乙二醇；聚唾液酸；嵌段聚合；尿酸酶；緩釋

目前，隨著生物醫(yī)藥技術的發(fā)展，各種蛋白及多肽類藥物更好地保障了人類健康。2012年，該類藥物總銷售額達1 246億美元，且每年都繼續(xù)穩(wěn)定增長。但是，蛋白類藥物存在著穩(wěn)定性差、易被酶降解、半衰期短、生物利用度低等缺點，非人源蛋白自身具有免疫原性，進入人體易引起抗體反應，從而加速血液清除，降低了藥效［1］。對蛋白質(zhì)類藥物的改造成為當下研究的熱點，目前比較成熟、成功的方法是聚乙二醇（PEG）修飾。PEG修飾使用較多的是單甲氧基聚乙二醇（mPEG）修飾劑，目前已經(jīng)應用在包括尿酸酶［2-3］、天冬酰胺酶［4］、胰島素［5］、白細胞介素-2［6］、CC49/218單鏈抗體［7］、干擾素α-2b［8］和腫瘤壞死因子納米抗體［9］等蛋白及多肽上。修飾后蛋白穩(wěn)定性普遍提高，半衰期延長，免疫原性降低，生物利用度提高。由于PEG為人工合成，相對分子質(zhì)量較大，其很難通過腎小球被尿液排出，在體內(nèi)降解非常緩慢，造成聚乙二醇在機體內(nèi)的積累［10］。已有研究證明，聚乙二醇在溶酶體內(nèi)的積累具有毒性［11］，且慢性治療中，頻繁注射聚乙二醇化蛋白易產(chǎn)生抗體［12］。

與此同時，采用聚唾液酸（PSA）作為蛋白修飾劑的研究也在進行。聚唾液酸是由唾液酸單體（N-乙酰神經(jīng)氨酸）以α-2，8糖苷鍵連接成的聚陰離子多糖［13］，其單體廣泛存在于人和動物體內(nèi)細胞表面的寡糖鏈末端，因而表現(xiàn)出良好的生物相容性、生物可降解性及抗人體免疫系統(tǒng)識別功能［14］。目前，常見的方法是還原氨基化，已在研究的蛋白包括過氧化氫酶［15］、天冬酰胺酶［16-17］、胰島素［18］、超氧化物歧化酶［19］及丁酰膽堿酯酶［20］等。聚唾液酸化蛋白不存在免疫原性，但修飾程度往往不及聚乙二醇化的修飾程度，且聚唾液酸水化能力稍弱。

尿酸酶能將尿酸降解為溶解度高其13倍的尿囊素，在治療頑固性痛風及高尿酸血癥方面有較好的效果。但作為外源蛋白，尿酸酶在體內(nèi)易被酶水解，穩(wěn)定性低、免疫原性較強，因而限制了它的應用。本研究中筆者結(jié)合PEG與PSA的優(yōu)點，以尿酸酶為對象，采用全新的嵌段聚合修飾方法，將活化的聚唾液酸與小分子PEG形成嵌段聚合物，用于修飾尿酸酶，使其兼具聚唾液酸的抗免疫識別和PEG的強吸水性能［21］，以提高穩(wěn)定性和半衰期。

1 材料與方法

1.1 材料

聚唾液酸為筆者所在實驗室成員發(fā)酵純化所得（E.coli K235），數(shù)均相對分子質(zhì)量3.42×104；尿酸酶，來源于假絲酵母基因，在大腸桿菌中表達，SDS-PAGE鑒定相對分子質(zhì)量為3.5×104。尿酸、5，5′-二硫雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）購自南京都萊有限公司；異基雙功能PEG（MAL-PEG-NHS）購自北京鍵凱科技有限公司，相對分子質(zhì)量為3 592；蛋白Marker、胰蛋白酶（1∶300）購自上海生工工程有限公司；透析袋（7000）、超濾離心管（3000）購自上?；强萍加邢薰荆黄渌噭┚徸試幖瘓F化學試劑公司，化學純。

1.2 方法

1.2.1 聚唾液酸的活化

稱取純化的PSA 200mg溶于50mL加蓋試管，加入10mL 0.1 mol/L高碘酸鈉，室溫避光振蕩15min，加10mL乙二醇終止反應，繼續(xù)振蕩30min，然后在0.02%（質(zhì)量分數(shù)）（NH4）2CO3透析液中4℃透析24 h。透析液用超濾離心管濃縮，加入100倍摩爾比的胱胺鹽酸鹽，滴加0.1 mol/L NaOH調(diào)pH 7.4，37℃磁力攪拌1 d，加入與胱胺鹽酸鹽等摩爾的二硫蘇糖醇，37℃反應1 h，反應液用相對分子質(zhì)量為3 000的離心超濾管4 000g×30min超濾8次，除去未反應的小分子，濃縮得到非還原端官能團為巰基的活性唾液酸［21］。

1.2.2 聚唾液酸活化程度測定

5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）法：將DTNB溶于50 mmol/L pH 7.0的Na2HPO4中制成10 mmol/L的DTNB標準液。將標準液用0.25 mol/L pH 8.3的Tris-HCl緩沖液稀釋100倍制得DTNB分析液。將活化的PSA稀釋至1mL，分別加入到5mL預先恒溫于25℃水浴中的DTNB分析液，搖勻，靜置10min，立即于波長412 nm處測定吸光值（A），以半胱氨酸為標準。通過DTNB法測定巰基含量（mmol）后，再除以PSA的量（mmol）即可獲得聚唾液酸的活化程度。

1.2.3 PEG-PSA嵌段聚合修飾尿酸酶

按照摩爾比1∶1，將具有活性巰基的PSA與PEG在25℃反應0.5 h，然后按摩爾比50∶1加入尿酸酶，于4℃冰水浴反應2 h。

1.2.4 修飾尿酸酶的純化

采用分子篩柱進行純化。柱子尺寸：16mm× 270mm；填料：TOSOH Toyopearl HW-55F；流動相：20 mmol/L pH 7.4 H3PO4緩沖液，0.15 mol/L NaCl；洗脫條件：流速0.7mL/min；檢測器：示差折光檢測器串聯(lián)紫外檢測器（λ=215 nm）。

1.3 綴合物的表征

1.3.1 溫度穩(wěn)定性

將等量天然酶和修飾酶置于50和60℃水浴保溫，定時（1、2、3、4、5和6 h），取100 μL置于冰浴測定酶活，以各溫度下0 h的原始酶活為對照。

1.3.2 酸堿穩(wěn)定性

取等量天然酶和修飾酶，在37℃，pH為6.0、7.0（H3PO4緩沖液）、8.0、9.0和10.0（H3BO3緩沖液）水浴2 h后測定酶活（25℃，pH 8.5 H3BO3緩沖液）。以各pH下0 h的原始酶活為對照。

1.3.3 抗酶解穩(wěn)定性

取500 μL 0.1mg/mL尿酸酶，按體積比10∶1加入胰蛋白酶液（1%，20 mmol/L、pH 6.8 H3PO4緩沖液），在37℃水浴保持0、0.5、1、2和3 h后取樣測定酶活，計算酶活保留率。

1.3.4 酶動力學參數(shù)測定

取180 μL不同濃度尿酸溶液（40～140 μmol/L）于石英96孔板，加入0.1mg/mL尿酸酶在25℃反應3min，每15 s記錄1次293 nm波長處的吸光值，計算反應速率。最大反應速率和米氏常數(shù)的測定采用Lineweave-Burk雙倒數(shù)作圖。

1.4 尿酸酶酶活的測定

根據(jù)尿酸于293 nm處有特征吸收，測定尿酸被尿酸酶氧化生成尿囊素后，剩余尿酸在293 nm處的吸光值。酶活測定反應體系均為0.1 mol/L H3BO3緩沖液（pH 8.5），以0.001%的尿酸為底物，25℃反應3min，每15 s記錄一次293 nm波長處的吸光值。以每分鐘催化1 μmol尿酸分解所需要的酶量定義為1個酶活力單位（U）。

1.5 聚唾液酸含量測定

聚唾液酸含量采用間苯二酚法，以N-乙酰神經(jīng)氨酸為標品［22］。

1.6 蛋白含量測定

蛋白質(zhì)含量測定參照文獻［23］進行，以牛血清白蛋白為參照。

1.7 聚乙二醇含量測定

將待測溶液稀釋至4mL，然后加入1mL 5% BaCl2和0.5mL 0.1 mol/L碘溶液，15min后在535 nm處測定吸光值［24］，以 PEG（相對分子質(zhì)量4 000）為參照（0～15mg/L）。

1.8 相對分子質(zhì)量測定

1.8.1 聚唾液酸相對分子質(zhì)量測定

聚唾液酸相對分子質(zhì)量采用十八角度激光光散射凝膠系統(tǒng)（Wyatt Technology，USA）進行監(jiān)測。色譜柱為Shodex-Ohpak SB-804 HQ串聯(lián)Ohpak SB-802 HQ，流動相為0.1 mol/L NaNO3，流速為0.5mL/min，檢測器為Wyatt DAWN HELEOSⅡ十八角度激光光散射儀串聯(lián)Optilab T-rEX示差折射率檢測器，標品為T40，相對分子質(zhì)量4.0×104。

1.8.2 尿酸酶、綴合物相對分子質(zhì)量測定

聚唾液酸-聚乙二醇修飾尿酸酶綴合物的相對分子質(zhì)量采用十八角度激光光散射凝膠系統(tǒng)進行監(jiān)測，色譜柱為Shodex-Ohpak SB-806 HQ，流動相為0.1 mol/L NaNO3，流速為0.4mL/min，檢測器為Waters UV/VISIBLE串聯(lián)Wyatt DAWN HELEOSⅡ十八角度激光光散射儀串聯(lián)Optilab T-rEX示差折射率檢測器。

1.9 SDS-PAGE電泳分析

SDS-PAGE電泳用于監(jiān)測尿酸酶修飾前后的相對分子質(zhì)量變化，采用質(zhì)量分數(shù)12%分離膠和5%濃縮膠［25］。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚唾液酸活化

聚唾液酸非還原端C7～9位有3個相鄰的醇羥基，反應活性較弱，通過活化得到活性巰基，進而與PEG修飾劑的馬來酰亞胺官能團發(fā)生加成反應，形成嵌段聚合物。先用高碘酸鈉特異性地氧化醇羥基得到醛基，接著與胱胺鹽酸鹽反應，最后用二硫蘇糖醇還原，切斷二硫鍵，得到末端巰基。經(jīng)過透析和離心超濾兩步純化，累積回收率為（68.2± 4.5）%（n=3），活化程度為（38.6±2.68）%（n=3）。由于聚唾液酸是大分子，本身活化不易進行，且產(chǎn)生的末端巰基在空氣中不是很穩(wěn)定，較易被氧化，因此活化程度不是特別高。

2.2 PEG-PSA嵌段聚合修飾尿酸酶

活化的聚唾液酸先與雙官能團PEG修飾劑的馬來酰亞胺發(fā)生加成反應，形成嵌段聚合物，然后PEG的另一官能團（NHS）與尿酸酶上賴氨酸殘基的氨基發(fā)生親電取代反應，形成酰胺鍵。尿酸酶通過嵌段聚合修飾后，相對分子質(zhì)量增大，未修飾酶及其他副產(chǎn)物相對分子質(zhì)量則較小，反應產(chǎn)物通過分子篩層析進行純化，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：按照示差信號共收集4個峰，對收集的峰進行化學鑒定，分別測定其聚唾液酸、聚乙二醇和蛋白含量。

發(fā)現(xiàn)只有第1個峰檢測到聚唾液酸，其他3個峰未檢出；第1和第2個峰均檢測到聚乙二醇，第3和第4個峰未檢出，且峰1的聚唾液酸含量最高；第1、第2和第4個峰均檢測到蛋白，且峰1蛋白含量最高。TOSOH Toyopearl HW-55F分子篩色譜柱填料是由甲基丙酸烯聚合而成的基質(zhì)，主要依靠分子流體力學半徑分離物質(zhì)，嵌段聚合修飾尿酸酶后，尿酸酶的水化半徑顯著增大，所以第1個出峰。第2個流出峰為少量聚乙二醇連接的蛋白，第3個流出峰為溶劑峰，第4個峰只檢測到蛋白，且215 nm處有紫外吸收，應為沒有修飾的尿酸酶，可能與填料上的羧基存在靜電相互作用，所以最后出峰。

圖1 分子篩層析純化尿酸酶修飾產(chǎn)物結(jié)果Fig.1 Gel permeation chromatography of modified uricase

2.3 綴合物的表征結(jié)果分析

2.3.1 SDS-PAGE結(jié)果分析

除了進行化學鑒定，還對收集的峰進行進一步SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：未修飾尿酸酶單體相對分子質(zhì)量約3.5×104，純化收集第1個峰為修飾產(chǎn)物，單體相對分子質(zhì)量約4.5×104，還有一模糊條帶為5.5×104，可能還有更高相對分子質(zhì)量的產(chǎn)物（由于比例較低，未出現(xiàn)條帶）。多條帶的出現(xiàn)可能是由于嵌段聚合修飾是隨機修飾，造成產(chǎn)物的不均一性。由相對分子質(zhì)量半對數(shù)—遷移率曲線所計算得到的相對分子質(zhì)量并不能反映修飾產(chǎn)物的真實相對分子質(zhì)量，因為PEG吸水較強，導致泳動速率較慢，得到的相對分子質(zhì)量偏大［3］；但同時作為嵌段聚合物之一的PSA是陰離子多糖，與十二烷基磺酸（SDS）所帶電荷一致，導致修飾產(chǎn)物可能泳動速度較快［26］。總之，修飾產(chǎn)物相對分子質(zhì)量的電泳行為同時受到PEG和PSA的影響。第2個峰由于蛋白含量較低，未出現(xiàn)條帶。第4個峰的相對分子質(zhì)量與單體相對分子質(zhì)量一致，分析為未被修飾的尿酸酶。

2.3.2 PSA-PEG修飾尿酸酶的相對分子質(zhì)量表征及生化參數(shù)

通過多角度激光光散射凝膠系統(tǒng)測定修飾尿酸酶的相對分子質(zhì)量，結(jié)果如圖3所示。

圖2 純化產(chǎn)物電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified uricase from GPC

圖3 尿酸酶-PEG-PSA綴合物的相對分子質(zhì)量分布Fig.3 Molecular weight distribution of modified uricase-PEG-PSA conjugate

一般尿酸酶是四聚體（相對分子質(zhì)量1.412× 105），由圖3可知：在連接上PSA-PEG后，相對分子質(zhì)量變成5.214×105。PSA和PEG的相對分子質(zhì)量為3.42×104和3.5×103，通過計算（5.214×105-1.412×105）/（3.42×104+3.5×103）=10.08，則平均每個尿酸酶單體連接2.52個嵌段聚合物修飾劑。盡管尿酸酶每個單體含有32個賴氨酸殘基，但是理論上只有10～12是可以接近的?？赡苁沁@些賴氨酸殘基相距較近，嵌段聚合物連在其中一個位點，由于空間位阻，其他修飾劑將無法連接［27-28］。此外，聚唾液酸是陰離子多糖，同時還存在電荷排斥，因此，修飾程度可能不及PEG修飾。蛋白質(zhì)化學修飾往往是隨機修飾，可能與活性部位的賴氨酸發(fā)生作用，導致酶活降低，經(jīng)測定，嵌段聚合修飾后酶活保留率為72.4%。Zhang等［29］采用含羥基琥珀酰亞胺官能團的mPEG 350和mPEG 5k，修飾來自苛求芽胞桿菌的尿酸酶，酶活保留率分別為15%和65%；Bomalaski等［30］用PEG 5000 MW修飾假絲酵母尿酸酶，酶活保留率50%。在37℃恒溫孵育箱測定體外半衰期，酶的熱失活半衰期由115.5 h提高到231 h，提高1倍。Zhang等［29］采用PEG修飾后，在40℃熱失活半衰期由40 h提高至85 h，嵌段聚合修飾結(jié)果與其接近。

2.3.3 PSA-PEG修飾尿酸酶的溫度穩(wěn)定性

大部分蛋白酶在較高溫度下，天然構象遭到破壞，從緊密有序趨向隨即松散，折疊結(jié)構打開，導致酶活性喪失。尿酸酶-PEG-PSA綴合物的溫度穩(wěn)定性如圖4所示。

圖4 尿酸酶-PEG-PSA綴合物的溫度穩(wěn)定性Fig.4 Stability of uricase-PEG-PSA conjugate under different temperature

由圖4可知：在50℃下，2 h內(nèi)修飾酶基本未損失酶活，原始酶則損失了15%的酶活，6 h后修飾酶酶活保留率為72%，而原始酶則僅為60%。更高的溫度（60℃）下，修飾酶和原始酶酶活損失都較大，但修飾酶在6 h后酶活剩余34%，原始酶則為27%。整體而言，修飾后尿酸酶比原始尿酸酶對溫度的耐受性更強，這有利于酶的儲運，即使短暫暴露于較高的溫度條件下，亦能保留較多酶活。推測原因，可能是酶的活性位點受到嵌段聚合物的保護，提高了尿酸酶蛋白的剛性［31］。

2.3.4 PSA-PEG修飾尿酸酶的酸堿穩(wěn)定性

pH對酶穩(wěn)定性具有重要的影響，反應體系pH的變化，會影響酶活性部位的基團解離狀態(tài)，從而影響酶的活性。極端的pH會使維護酶三維結(jié)構的部分——非共價鍵受到干擾，導致酶自身的變性?？疾炷蛩崦?PEG-PSA綴合物的酸堿穩(wěn)定性，結(jié)果見圖5。

由圖5可知：在不同pH條件下處理2 h后，修飾尿酸酶酶活保留率高于原始酶，其中在堿性條件下較為明顯。在pH 10時，修飾酶比原始酶酶活高出22%，而在接近人體血液pH條件下，修飾酶殘余酶活70%，原始酶活則為60%，修飾酶更加穩(wěn)定，顯示出良好的臨床應用前景。在酸性條件下，修飾酶和原始酶酶活損失都較多，因為尿酸酶屬過氧化物酶，在堿性pH條件下有最大酶活，酸性條件下酶易降解失活。另外，修飾劑之一的聚唾液酸在堿性條件下穩(wěn)定，酸性條件下糖苷鍵也會被水解［14］，所以酸性條件下酶的穩(wěn)定性提高不多。

圖5 尿酸酶-PEG-PSA綴合物的酸堿穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of uricase-PEG-PSA conjugate

2.3.5 PSA-PEG修飾尿酸酶的酶解穩(wěn)定性

蛋白酶藥物進入體內(nèi)后，由于體內(nèi)較多的蛋白酶存在，使得酶蛋白被水解，多肽鏈斷裂，蛋白酶的功能結(jié)構受到破壞而喪失活性，因此必須考察尿酸酶修飾后對蛋白酶的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6所示。

圖6 尿酸酶-PEG-PSA綴合物的抗酶解穩(wěn)定性Fig.6 Protease resistant stability of uricase-PEG-PSA conjugate

由圖6可知：在0.5 h時，修飾尿酸酶酶活殘余85%，而原始酶為60%，3 h后修飾尿酸酶殘余酶活34%，原始酶則只剩20%。尿酸酶修飾后，對胰蛋白酶的耐受性顯著增加，穩(wěn)定性提高，在體內(nèi)能更加持久地發(fā)揮藥效，可減少給藥劑量，降低治療成本，同時也可減少病人的痛苦（目前臨床尿酸酶的給藥途徑主要是靜脈注射）。推測原因，可能是尿酸酶上暴露在外面的蛋白酶識別位點被嵌段聚合修飾劑共價連接后，識別位點被掩蔽，無法被蛋白酶識別，進而降解，另外聚唾液酸具有較強的負離子性，與酶蛋白周圍帶相反電荷的氨基酸殘基相互作用，形成第二層保護層［19］。

2.3.6 PSA-PEG修飾尿酸酶的動力學參數(shù)

分別比較原始尿酸酶與修飾尿酸酶的動力學參數(shù)，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，尿酸酶修飾后，米氏常數(shù)Km減小，對底物的親和能力增強，最大反應速率Vmax增大，催化效率提高。Zhang等［29］用mPEG 350和mPEG 5k修飾尿酸酶后Km沒有明顯的變化。尿酸酶修飾后并沒有因為嵌段聚合修飾劑的屏蔽效應，造成底物與酶親和能力的下降，推測原因，可能是酶的溶解度較低［32］，但是PEG的強吸水性能加上聚唾液酸的高度親水性，增加了酶的溶解度，使酶與底物的親和能力增強。酶修飾后最大反應速率與催化效率均有所增加。

表1 尿酸酶的動力學參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of modified uricase

3 結(jié)論

本研究確定了一種以聚唾液酸-聚乙二醇嵌段聚合物修飾蛋白的方法。采用異基雙功能聚乙二醇-MAL-PEG-NHS為接頭，將聚唾液酸與尿酸酶鏈接起來，平均每個尿酸酶單體交聯(lián)2.52個PEG-PSA嵌段聚合物，酶活保留率為72.4%，熱失活半衰期由115.5 h提高到231 h。另外，米氏常數(shù)Km由原始酶的239.7 μmol/L降為162.6 μmol/L，最大反應速率Vmax由原始酶的83.3 μmol/（L·min）增大為90.9 μmol/（L·min），kcat由1.94 s-1增大為2.12 s-1。PSAPEG嵌段聚合修飾蛋白程度不如PEG修飾，但由于其易降解，不產(chǎn)生免疫反應，可用于進一步臨床實驗，在未來可能是一種替代PEG修飾的更好方法。

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（責任編輯 管 珺）

Uricase modification with polysialic acid and polyethylene glycol（PEG-PSA）co-polymer

LU Shaozeng，WU Jianrong，ZHU Li，ZHENG Zhiyong，ZHAN Xiaobei
（Key Labroratory of Carbohydrate Chemistry&Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

A novel protein modification method was developed by integrating the advantages of polysialic acid（PSA）and polyethylene glycol（PEG）.PSA was activated by two steps：the aldehyde group was generated by periodate oxidation at the non-reducing end，and then the active thiol group was formed using cystamine.The activated PSA（3.4×104）reacted with hetero-bifunctional PEG（3.5×103）to form a block co-polymer，and modified uricase at 4℃.The conjugate was purified with gel permeation chromatography and the target peak was collected and identified with chemical method and SDS-PAGE. The molecular weight of the conjugate was 5.214×105through multi-angle laser light scattering gel system.Compared with native enzyme，residual enzyme activity was 72.4%，and heat inactivation half life in vitro was improved from 115.5 h up to 231 h.The tolerance stability from heat，acid and alkaline，trypsin treatment was significantly improved.

polyethyleneglycol；polysialic acid；block polymerization；uricase；controlled-release

Q55

A

1672-3678（2015）02-0086-07

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.017

2014-01-25

江蘇省自然科學基金（BK2011158）

盧紹曾（1987—），男，河南鄭州人，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程；吳劍榮（聯(lián)系人），副教授，E-mail：kinowu76@163.com