馬 蘭 靳國恩 楊應(yīng)忠 韻海霞 白振忠 格日力

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心，西寧810001)

人類白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)系統(tǒng)是一群與人的免疫應(yīng)答反應(yīng)密切相關(guān)的基因簇，定位于6p21．31區(qū)，長3 600 kb，是目前所知人體內(nèi)最復(fù)雜的顯性多態(tài)及免疫遺傳系統(tǒng)，成為研究人類群體遺傳特征的最佳遺傳標(biāo)志。研究表明，HLA等位基因的分布具有顯著的種族、地域特異性，并且由于HLA等位基因間存在連鎖不平衡，其分布也具有明顯的種族和地域差［1，2］。因此，對不同地域的聚居少數(shù)民族進(jìn)行HLA等位基因頻率的研究，了解其分布特征，對尋找HLA相合無關(guān)供者具有實際意義;同時也可以為人類學(xué)、免疫遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)、疾病相關(guān)性研究等提供和積累基礎(chǔ)資料。土族是青海省特有的民族，分布比較集中，民族間通婚現(xiàn)象比較少，其基因的保守性強，形成自己獨特的遺傳基因頻率分布。我們采用聚合酶鏈反應(yīng)-直接測序分型(Polymerase chain reaction sequencebased typing，PCR-SBT)方法對青海土族地區(qū)人群中47名健康無關(guān)個體進(jìn)行HLA-A、B、DRB1基因座高分辨分型，從而了解青海土族人群中HLA等位基因分布情況及特點。

1 對象與方法

1．1對象 青海土族地區(qū)健康人47名，其中男性14名，女性33名。

1．2 主要儀器試劑 ABI29700型PCR擴(kuò)增儀、蛋白酶-K、TaqDNA聚合酶(華美生物公司);BigDye?Terminator測序試劑盒、ABI-3730XL型DNA測序儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster city，CA，USA)。

1．3 基因組DNA制備 靜脈采血2 ml，加EDTA(乙二胺四乙酸)抗凝后于－20℃冷凍保存;根據(jù)微量快速鹽析法使用蛋白酶-K從外周血白細(xì)胞中提取基因組DNA;使用瓊脂糖凝膠電泳法收集、純化并測定DNA濃度。

1．4 PCR擴(kuò)增 取10 μl PCR引物混合物(其中含有HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1的2對、1對、7對組特異性正反向引物)，加入3．0 μl上述DNA稀釋液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:96℃2分鐘、96℃ 30秒;60℃ 30秒，72℃ 1分鐘，35個循環(huán);最后72℃10分鐘。

1．5 測序反應(yīng) 5 μl特異性測序反應(yīng)體系(其中含有HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1的3對、2對、1對組特異性正反向引物)，含有1 μl PCR純化產(chǎn)物。測序反應(yīng)條件:96℃2分鐘;96℃10秒，50℃5秒，60℃ 4分鐘，25個循環(huán);4℃保溫。在純化測序反應(yīng)產(chǎn)物后使用熒光標(biāo)記雙脫氧法測序。

1．6 等位基因識別 使用Sequencing AnalysisTM、MatchToolsTM、MT NavigatorTM(Applied Biosystems ，F(xiàn)oster City，USA)系列軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并識別等位基因。

1．7 統(tǒng)計學(xué)分析 直接計數(shù)法計算 HLA-A、B、DRB1基因頻率、基因型頻率。

2 結(jié)果

2．1 Hardy-Weinberg 平衡檢驗 HLA-A、B、DRB1基因座分別經(jīng)Hardy-Weinberg吻合度檢驗，期望值與觀察值無顯著差異(P＞0．05)，說明該研究群體的基因分布具有代表性。

2．2 青海土族人群HLA-A、B、DRB1等位基因頻率分布特征 在本研究中，47名青海土族地區(qū)健康無關(guān)個體的HLA-A位點上共檢出34種基因型和17種等位基因(表1)，最常見5種按頻次由大到小分別 為 110101/240201、110101/310102、020101/110101、020101/240201、020301/110101 和 110101、240201、020101、330301、310102;B 位點上共檢出 41種基因型和28種等位基因(表2)，最常見5種按頻次由大到小分別為150101/5401、150101/510101、380201/5801、4601/510101、 510101/550201 和510101、150101、3503、5801、4601;DRB1 位點上共檢出42種基因型和30種等位基因(表3)，最常見的5種按頻次由大到小分別為040501/090102、040501/120201、120101/140101 和 040501、140101、070101、090102、110101。

2．3 青海土族人群與不同人群HLA-DRB1等位基因頻率分布特征比較 由表4可見，青海土族HLADRB1等位基因頻率分布與蒙古族有相似之處，表現(xiàn)為:DRB1*04，DRB1*07，DRB1*09，DRB1*12等位基因頻率較高。DRB1*02，DRB1*03，DRB1*16等位基因頻率低。

表1 青海土族人群HLA-A等位基因頻率分布(n=47)Tab．1 The allele distribution frequency of HLA-A in Tu nationality of Qinghai Province(n=47)

表2 青海土族人群HLA-B等位基因頻率分布(n=47)Tab．2 The allele distribution frequency of HLA-B in Tu nationality of Qinghai Province(n=47)

表4 青海土族人群與國內(nèi)其他民族HLA-DRB1等位基因頻率比較(%)Tab．4 Compare the HLA-DRB1 allele gene frequency between Tu nationality in Qinghai and domestic other nationalities

表3 青海土族人群HLA-DRB1等位基因頻率分布(n=47)Tab．3 The allele distribution frequency of HLA-DRB1 in Tu nationality of Qinghai Province(n=47)

3 討論

HLA等位基因系統(tǒng)是已知人類最復(fù)雜的顯性多態(tài)遺傳系統(tǒng)，成為研究人類群體遺傳特征的最佳遺傳標(biāo)志。國外已對不同人種和民族的HLA分布情況作了大量的調(diào)查和研究，國內(nèi)關(guān)于HLA群體遺傳學(xué)的研究也在不斷地深入。群體HLA基因多態(tài)性的研究在追溯人類(民族)起源、進(jìn)化、遷徙、融合等人類遺傳學(xué)研究，法醫(yī)學(xué)個體識別，干細(xì)胞和器官移植以及疾病相關(guān)性研究等諸多方面有較大的應(yīng)用價值和重要意義［7-9］。

土族是中國人口較少的民族之一，現(xiàn)有人口大約接近20萬。主要聚居于青海省東部湟水以北、黃河兩岸及其毗連地區(qū)。青海省境內(nèi)的土族約占全國土族總?cè)丝诘?5%。長期以來，土族族源問題一直受到民族史和地方史學(xué)界的關(guān)注，至今仍存在爭論，主要有吐谷渾說、蒙古人或以蒙古人為主融合霍爾人等各族說等［10］。本研究運用PCR-SBT技術(shù)方法對青海土族人群中的HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1基因多態(tài)性進(jìn)行分析，在HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1基因座分別檢出34、41、42個基因型和17、28、30個等位基因。其中HLA-A的基因型和等位基因分別以 10101/240201、110101/310102、020101/110101、020101/240201、020301/110101 和 110101、240201、020101、330301、310102常見，HLA-B 的基因型和等位 基因分別以 150101/5401、150101/510101、380201/5801、4601/510101、510101/550201 和 510101、150101、3503、5801、4601 常見，HLA-DRB1 的基因型和等位基因分別以040501/090102、040501/120201、120101/140101 和 040501、140101、070101、090102、110101常見。這表明，青海土族人群HLA基因座的基因型和等位基因具有較高的遺傳多態(tài)性，而且具有其自身的特點。此外，我們還對青海土族人群的HLA-DRB1等位基因頻率分布與國內(nèi)其他民族做了比較，發(fā)現(xiàn)青海土族HLA-DRB1等位基因頻率分布與蒙古族確實有相似之處，表現(xiàn)為:DRB1*04，DRB1*07，DRB1*09，DRB1*12等位基因頻率較高。DRB1*02，DRB1*03，DRB1*16等位基因頻率低。這一結(jié)果與曹海霞等［9］的報道是基本一致的。但由于樣本資料有限，結(jié)果在一定程度上可能會存在誤差，今后還需加大樣本量開展更深入的研究，從遺傳背景的角度為解釋土族的歷史源流提供一定的數(shù)據(jù)資料。

1 Shankarkumar U，Sridharan B，Pitchappan R M．HLA diversity among Nadars，a primitive Dravidian caste of south India［J］．Tissue Antigens，2003;62(6):542-547．

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3 沈春梅，朱波峰，李生斌．內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族HLA-A，B，DRB1基因多態(tài)性研究［J］．遺傳，2008;30(2):164-168．

4 侯 玲，劉 杰，李 鑫 et al．黑龍江地區(qū)蒙古族 HLA-A、B、DRB1等位基因及單體型的研究［J］．中國輸血雜志，2010;23(11):929-933．

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9 曹海霞，徐 昕，洪 軍．青海土族人群HLA-DRB1等位基因多態(tài)性分析［J］．中國免疫學(xué)雜志，2008;24(11):1018-1020．

10 孟 航．淺析中國土族人口分布格局及其社會發(fā)展［J］．青海民族研究，2005;16(4):22-29．