李培培 解國(guó)雄 宋珊珊 黃 蓓 吳育晶 汪慶童 常 艷 張運(yùn)芳 周愛武 劉麗華 張玲玲 魏 偉

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所抗炎免疫藥理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室抗炎免疫藥物安徽省工程技術(shù)研究中心，合肥230032)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是以損害滑膜、軟骨和骨的一種慢性、炎癥性自身免疫疾?。?］。大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis，AA)模型在臨床表現(xiàn)、病理學(xué)、免疫學(xué)改變和病理機(jī)制等方面與人RA有許多相似特征，是研究RA病理機(jī)制和評(píng)價(jià)治療RA藥物的較理想動(dòng)物模型［2］。本文成功建立了大鼠AA模型，從整體和關(guān)節(jié)局部詳細(xì)描述了大鼠AA模型的炎癥表現(xiàn)特征，確立了大鼠AA模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)，包括全身評(píng)分、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、足爪腫脹度、足爪X線攝片、踝關(guān)節(jié)病理等，旨在為建立AA模型研究RA病理機(jī)制及評(píng)價(jià)RA治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物 Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，清潔級(jí)，體重130～170克，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)碼:SCXK(滬)2008-0016。在恒溫(24±2)℃、光照周期12小時(shí)∶12小時(shí)環(huán)境中飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。

1．2 試劑 卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG):北京生物制品所產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào):20090324。液體石蠟:天津市化學(xué)試劑三廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào):20020928。

1．3 方法

1．3．1 實(shí)驗(yàn)分組 SD大鼠，隨機(jī)分為2組，即對(duì)照組、模型組，每組10只。

1．3．2 大鼠AA模型的制備 將BCG 80℃水浴滅活1小時(shí)，與高壓滅菌的石蠟充分研磨、混勻，制成10 mg/ml完全弗氏佐劑(Complete Freund adjuvant，CFA)，于每只大鼠右后足跖皮內(nèi)注射CFA 0．1 ml致炎［3］。對(duì)照組用生理鹽水同法注射。

1．4 檢測(cè)指標(biāo)

1．4．1 臨床體征評(píng)分

(1)全身評(píng)分 從炎癥出現(xiàn)后，每隔3～4天進(jìn)行全身表現(xiàn)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)包括:耳:0=無結(jié)節(jié)和發(fā)紅癥狀，1=一只耳朵結(jié)節(jié)和發(fā)紅癥狀，2=兩只耳朵結(jié)節(jié)和發(fā)紅癥狀;鼻:0=無結(jié)締組織腫脹，1=明顯結(jié)締組織腫脹;尾:0=無結(jié)節(jié)，1=有結(jié)節(jié);前足爪:0=無腫脹，1=一個(gè)前足爪腫脹，2=兩個(gè)前足爪腫脹;后足爪:0=無腫脹，1=一個(gè)后足爪腫脹，2=兩個(gè)后足爪腫脹。每只大鼠最多評(píng)8分［4］。

(2)關(guān)節(jié)炎指數(shù) 從炎癥出現(xiàn)后，每隔3～4天進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，觀察每組大鼠的繼發(fā)病變。每只足爪的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0=正常;1=踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕微腫脹;2=踝關(guān)節(jié)到跖關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)紅斑和輕微腫脹;3=踝關(guān)節(jié)到跖趾關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹;4=踝關(guān)節(jié)到趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和重度腫脹。每只大鼠最多評(píng)12分［5］。

(3)關(guān)節(jié)腫脹數(shù) 從炎癥出現(xiàn)后，每隔3～4天計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹數(shù)。每只足爪計(jì)1個(gè)踝關(guān)節(jié)(或腕關(guān)節(jié))和5個(gè)指(趾)關(guān)節(jié)，每只大鼠最多24個(gè)關(guān)節(jié)腫脹［4］。

(4)足爪腫脹度測(cè)定 致炎前用足容積測(cè)量?jī)x測(cè)量每個(gè)大鼠左后足(非致炎側(cè))容積，從炎癥出現(xiàn)后，每隔3～4天測(cè)量左后足容積，求出繼發(fā)側(cè)足爪腫脹度(Δml=︱注射后的足爪容積－注射前的足爪容積︱)［5］。

1．4．2 踝關(guān)節(jié)X片 致炎后第35天(d35)將各組大鼠四肢關(guān)節(jié)置XR/d型數(shù)字化X線成像系統(tǒng)下攝片(KV:40～50 V;mA:100 mA，S:32 ms)，觀察骨質(zhì)破壞情況。關(guān)節(jié)破壞分軟組織腫脹、骨侵蝕和關(guān)節(jié)間隙改變?nèi)齻€(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)［6］:

(1)軟組織腫脹 0分=正常;1分=輕微的腫脹;2分=中度腫脹;3分=嚴(yán)重腫脹。

(2)骨侵蝕評(píng)分 0分=正常;1分=可疑或一個(gè)微小局部病灶;2分=二個(gè)局部病灶或病灶總表面積≤50%;3分=三個(gè)以上的病灶或病灶總表面積＞50%;4分=關(guān)節(jié)面完全破壞，或出現(xiàn)骨縮小。

(3)關(guān)節(jié)間隙 0分=正常;1分=間隙內(nèi)出現(xiàn)可疑或一個(gè)微小局部病灶;2分=關(guān)節(jié)間隙出現(xiàn)狹窄，比正常關(guān)節(jié)間隙減少25%至50%;3分=關(guān)節(jié)強(qiáng)直或關(guān)節(jié)間隙消失。每只大鼠評(píng)價(jià)兩前足爪和繼發(fā)側(cè)后足爪，評(píng)分最大值為9。

1．4．3 踝關(guān)節(jié)病理學(xué)觀察 麻醉后脫臼處死大鼠，剪下后足炎性踝關(guān)節(jié)，分別用10%甲醛固定，不同濃度梯度乙醇逐級(jí)脫水，石蠟包埋、切片、進(jìn)行HE染色，Olympus光學(xué)顯微鏡觀察組織病理變化，并進(jìn)行病理評(píng)分。踝關(guān)節(jié)病理分別從滑膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵蝕、血管翳形成、炎癥和骨質(zhì)侵蝕評(píng)分［4］。

(1)滑膜細(xì)胞增殖評(píng)分:0=無增殖;1=輕微增殖，2～4層滑膜細(xì)胞;2=中度增殖，4層以上滑膜細(xì)胞;3=滑膜細(xì)胞過度增殖，侵蝕軟骨和骨，關(guān)節(jié)間隙消失。

(2)細(xì)胞侵蝕評(píng)分:0=無侵蝕;1=較少的1至2個(gè)細(xì)胞侵蝕灶;2=2至5個(gè)的局部細(xì)胞侵蝕灶;3=5個(gè)以上廣泛細(xì)胞侵蝕到關(guān)節(jié)囊。

(3)血管翳評(píng)分:0=無改變;1=兩個(gè)部位出現(xiàn)血管翳;2=四個(gè)部位出現(xiàn)血管翳，伴有軟骨表面的侵蝕;3=四個(gè)以上部位出現(xiàn)血管翳或二個(gè)部位出現(xiàn)大范圍的血管翳。

(4)炎癥評(píng)分:0=正常;1=輕度炎癥，出現(xiàn)1個(gè)聚集物或少量散在炎性細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及漿細(xì)胞)浸潤(rùn);2=中度炎癥，2個(gè)或2個(gè)以上的白細(xì)胞聚集物;3=重度炎癥，炎細(xì)胞大量浸潤(rùn)，大量白細(xì)胞聚集，分散浸潤(rùn)明顯。

(5)骨質(zhì)侵蝕評(píng)分:0=正常;1=微量侵蝕，1～2個(gè)小的淺部位;2=少量侵蝕，1～4個(gè)中等大小和深度部位;3=中等侵蝕，5個(gè)以上部位，局部侵蝕到骨皮質(zhì);4=重度侵蝕，多重?fù)p傷，局部或完全侵蝕到骨皮質(zhì);5=廣泛損傷，皮質(zhì)穿透骨長(zhǎng)度的25%以上。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS11．5軟件處理，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P＜0．05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 臨床體征觀察情況 大鼠AA原發(fā)病變主要表現(xiàn)為早期致炎部位的局部炎癥反應(yīng)，在發(fā)病過程中，大鼠精神萎靡、毛發(fā)失去光澤、多發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹和活動(dòng)障礙等。免疫后18小時(shí)，右后足爪腫脹達(dá)高峰，持續(xù)3天后逐漸減輕，免疫后d8再度腫脹;免疫后d13，模型組大鼠對(duì)側(cè)足爪開始出現(xiàn)繼發(fā)病變，d15模型大鼠普遍出現(xiàn)足爪紅腫，d19～d28達(dá)高峰，且發(fā)病率高達(dá)90%以上。表現(xiàn)為對(duì)側(cè)(左后肢)和前肢的腫脹，耳朵、鼻和尾根部出現(xiàn)“關(guān)節(jié)炎”結(jié)節(jié)等(圖1)，模型組大鼠在d15全身評(píng)分明顯升高，d19～d28達(dá)高峰(圖2)。

2．2 AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分情況 第一次免疫后，每隔3天，進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分。d11開始，AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高，隨著病程延長(zhǎng)，關(guān)節(jié)炎指數(shù)逐漸升高，d19～d28關(guān)節(jié)炎指數(shù)達(dá)高峰(圖3A、B)。

2．3 AA大鼠足爪腫脹度改變情況 AA大鼠在免疫后d7開始，每隔3天，對(duì)各組大鼠進(jìn)行足爪容積測(cè)定，d11開始，與對(duì)照組比較，各組AA大鼠足爪腫脹度升高，隨著病程延長(zhǎng)，腫脹度逐漸升高，免疫后d35，足爪仍然腫脹明顯。與對(duì)照組比較，有顯著性差異(P＜0．01見圖4)。

圖1 肉眼觀察AA大鼠足爪腫脹及全身病變情況Fig．1 Macroscopic observation on paw swelling and global assessment of AA rats

2．4 AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹數(shù)的變化情況 免疫后d11開始，各組AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹數(shù)明顯增加，隨著病程延長(zhǎng)，關(guān)節(jié)腫脹數(shù)逐漸升高，d19～d28 AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹數(shù)達(dá)高峰(圖5A、B)。

2．5 AA大鼠四肢關(guān)節(jié)X線攝片變化及評(píng)分 免疫后d35，進(jìn)行大鼠四肢踝關(guān)節(jié)足爪X線攝片，觀察關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞情況。并從軟組織腫脹、骨侵蝕和關(guān)節(jié)間隙三方面進(jìn)行評(píng)分?？梢夾A模型大鼠繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)軟組織腫脹，骨質(zhì)疏松、骨密度降低，骨侵蝕病灶明顯可見，關(guān)節(jié)間隙狹窄甚至消失。軟組織腫脹，骨侵蝕和關(guān)節(jié)間隙狹窄評(píng)分值，與對(duì)照組比較，有顯著性差異(P ＜0．01，圖6A、B)。

2．6 AA大鼠踝關(guān)節(jié)病理的影響 HE染色結(jié)果表明，正常大鼠關(guān)節(jié)滑膜由1～2層襯里細(xì)胞覆蓋在結(jié)締組織脂肪組織間質(zhì)的表面構(gòu)成。AA大鼠可見關(guān)節(jié)腔積液，炎性滲出，滑膜細(xì)胞增生(3～8層)水腫，血管翳形成，滑膜組織內(nèi)小血管增生，擴(kuò)張充血，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)為主。嚴(yán)重者炎性滑膜組織侵犯軟骨表面和軟骨下骨，或者炎性滑膜組織靠近關(guān)節(jié)軟骨;部分模型組滑膜組織表面或組織內(nèi)可見纖維素滲出或纖維素樣壞死物?；ぴ錾?、細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳、炎癥和骨侵蝕評(píng)分值增高，與正常組比較，有顯著性差異(P ＜0.01，圖7A、B)。

圖5 AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹數(shù)的變化Fig．5 Swollen joint count assessment on AA rats

圖6 AA大鼠繼發(fā)側(cè)踝關(guān)節(jié)足爪X線攝片變化情況Fig．6 The X-ray radiography changes on the AA rats'secondary side ankle joint

圖7 AA大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化及評(píng)分(HE，×100)Fig．7 The change on AA rats ankle joint histopathology and scores(HE，×100)

3 討論

AA是由細(xì)菌學(xué)家Freund 20世紀(jì)50年代創(chuàng)立，又稱弗氏佐劑性關(guān)節(jié)炎［7］。AA發(fā)病機(jī)制為:結(jié)核桿菌是相對(duì)分子量為65 kD的熱休克蛋白(HSP65)，與AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨的自身抗原HSP60有高度相似的保守序列，可以通過分子模擬和交叉反應(yīng)，激活處于靜止?fàn)顟B(tài)的針對(duì)Ⅱ型膠原為主的淋巴細(xì)胞克隆，從而引起自身免疫反應(yīng)［8］。AA大鼠表現(xiàn)為多發(fā)性外周關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)局部紅腫，嚴(yán)重致關(guān)節(jié)畸形。病理變化為增生性滑膜炎，關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨侵蝕，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。這些臨床表現(xiàn)與人RA相似，是篩選和研究治療 RA藥物的較理想模型。

目前我國(guó)建立AA模型的大鼠主要是SD大鼠、Wistar大鼠、Lewis大鼠三個(gè)品系。有學(xué)者報(bào)道，上述三種品系大鼠誘導(dǎo)膠原性關(guān)節(jié)炎模型，Wistar和SD大鼠發(fā)病率和發(fā)病程度均明顯高于Lewis大鼠，Wistar和SD大鼠發(fā)病率無顯著性差異，但發(fā)病程度SD大鼠明顯高于Wistar大鼠。三種品系大鼠雌雄之間發(fā)病率和發(fā)病程度無明顯差異［9］。

國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果從形態(tài)學(xué)、血清學(xué)、超微結(jié)構(gòu)的變化等多個(gè)特征來考察模型的建立情況，結(jié)果顯示大鼠AA表現(xiàn)為周圍性關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)腫脹，滑膜充血，水腫，滑膜排列疏松、紊亂，慢性病變則表現(xiàn)為滑膜組織的不規(guī)則增厚，關(guān)節(jié)軟骨破壞等［7，10］。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用完全弗氏佐劑誘導(dǎo)SD大鼠，成功建立了AA關(guān)節(jié)炎模型，結(jié)果顯示AA大鼠原發(fā)側(cè)和繼發(fā)側(cè)足爪及踝關(guān)節(jié)腫脹，活動(dòng)障礙，該模型既有關(guān)節(jié)局部的炎癥反應(yīng)，也有全身表現(xiàn)癥狀，如大鼠精神萎靡、毛發(fā)失去光澤、體重下降、耳朵、鼻和尾根部出現(xiàn)“關(guān)節(jié)炎”結(jié)節(jié)，且發(fā)病率高達(dá)90%左右等。

RA關(guān)節(jié)組織破壞的機(jī)制十分復(fù)雜，成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)是滑膜組織的重要組成成分，通過分泌各種細(xì)胞因子、蛋白酶類、花生四烯酸代謝產(chǎn)物等，在關(guān)節(jié)破壞過程中發(fā)揮重要作用［11，12］。從其病理特征來看，關(guān)節(jié)滑膜和周圍結(jié)締組織異常增殖，血管翳的形成是關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、關(guān)節(jié)破壞的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)AA大鼠關(guān)節(jié)X線攝片可見關(guān)節(jié)軟組織腫脹，骨質(zhì)疏松、骨密度降低，骨侵蝕病灶明顯可見，關(guān)節(jié)間隙狹窄甚至消失;病理學(xué)結(jié)果表明，AA大鼠滑膜細(xì)胞增生，血管翳形成，滑膜組織內(nèi)小血管增生，擴(kuò)張充血，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，嚴(yán)重者炎性滑膜組織侵犯軟骨表面和軟骨下骨。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的AA大鼠模型的關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)明顯，其病理改變和體征較大程度反映了RA的發(fā)病情況，關(guān)節(jié)炎指數(shù)、足爪X線片、踝關(guān)節(jié)病理等是評(píng)價(jià)AA模型的主要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)描述的AA大鼠建立方法和主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，為進(jìn)一步了解RA發(fā)病機(jī)制和評(píng)價(jià)新藥提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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