王 琳 甄 莉 (山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科，太原030001)

銀屑病是一種常見且易復(fù)發(fā)的慢性炎性皮膚病，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。近期的研究越來越關(guān)注抗微生物肽表達(dá)失調(diào)在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用［1］。HBD是抗微生物肽家族成員之一，不僅具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌等生物活性還是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁［2］。適量表達(dá)有抗微生物作用，過量表達(dá)意義尚不清楚。TNF-α作為促炎癥因子，在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，且大量研究表明，在體外實(shí)驗(yàn)中TNF-α能促進(jìn)HBD-2產(chǎn)生［3］。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時熒光 PCR(RTPCR)檢測尋常型銀屑病皮損處HBD-2及TNF-α mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步揭示二者之間的關(guān)系和在銀屑病發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1．1 對象 進(jìn)行期尋常型銀屑病患者45例，男25例，女20例;年齡在18～65歲，平均年齡31．8歲。問診排除取材前3個月內(nèi)系統(tǒng)使用過糖皮質(zhì)激素、維A酸、免疫抑制劑等藥物、光療，2周內(nèi)使用過外用藥物，以及合并其他內(nèi)臟疾病者。45例患者的銀屑病皮疹面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI評分)為6．9～55．2，按評分再將患者分為三組:＜24 為輕度組，25例;24～48為中度組，12例;＞48為重度組，8例。皮損標(biāo)本均取自軀干或四肢的典型皮損，在距離皮損＞1 cm處切取外觀正常的皮膚作為非皮損。正常對照組皮膚來自我院整形科手術(shù)切除的正常皮膚組織。標(biāo)本取下后，均立即液氮冷凍，－70℃冰箱保存。

1．2 實(shí)驗(yàn)材料

1．2．1 主要儀器與設(shè)備 TL988型實(shí)時熒光定量PCR儀(西安天隆科技有限公司);Y200C型電泳儀及JY-SCZ型電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)。

1．2．2 實(shí)驗(yàn)試劑 Transzol溶液、DNA marker由北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);PrimeScript?RT試劑盒及SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司。

1．2．3 引物設(shè)計及合成 引物設(shè)計參照GenBank序列，應(yīng)用Primer Premier 5．0軟件設(shè)計，確定序列后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。設(shè)β-actin為內(nèi)參照基因，其上游引物:5'-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3'，下游引物:5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段184 bp。HBD-2上游引物:5'-ATTCCTGATGCCTCTTCC-3'，下游引物:5'-GTGCCAATTTGTTTATACCTTC-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段 117 bp。TNF-α上游引物:5'-TCCTTCAGACACCCTCAACC-3'，下游引物:5'-AGGCCCCAGTTTGAATCCTT-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段173 bp。

1．3 方法

1．3．1 提取總RNA 嚴(yán)格按照Transzol溶液試劑盒說明書進(jìn)行操作提取，提出的RNA用紫外分光光度計測定其純度濃度，保存樣品于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

1．3．2 逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 反應(yīng)體系10 μl:5×PrimeScript? Buffer 2 μl，Prime Script? RT Enzyme Mix I 0．5 μl，Oligo dT Primer 0．5 μl，Random 6 mers 0．5 μl，Total RNA 2 μl ，RNase Freed H2O 4．5 μl。反應(yīng)條件:37℃15分鐘 ，85℃5秒。

1．3．3 RT-PCR步驟 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RT反應(yīng)，25 μl反應(yīng)體系:SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ 12．5 μl ，PCR Forward Primer 1 μl，PCR Reverse Primer 1 μl，DNA 模板 2 μl，滅菌蒸餾水 8．5 μl。預(yù)變性:95℃ 30秒1個循環(huán)。PCR反應(yīng):95℃5秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，讀取Ct值。

1．3．4 PCR產(chǎn)物電泳和相對定量分析 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl于瓊脂糖凝膠中電泳，以5 V/cm電泳20分鐘，紫外燈下觀察結(jié)果并攝影。結(jié)果顯示各組均有預(yù)期的陽性片段。經(jīng)測定目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增效率相同，通過△△CT值法計算其相對表達(dá)量。

1．4 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果使用SPSS17．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所得數(shù)據(jù)以x±s表示，相關(guān)性采用pearson或spearman相關(guān)分析;多組比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn);P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義;組間兩兩比較采用Bonferroni法，校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)后 α'=0．017，P ＜0．017 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 HBD-2 mRNA和TNF-α mRNA的表達(dá)在尋常型銀屑病皮損組顯著高于非皮損組和正常對照組(P ＜0．01);非皮損組高于正常對照組(P ＜0．01)。見表1。

2．2 在銀屑病皮損中HBD-2 mRNA與TNF-α mRNA的表達(dá)均成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=0．81;P＜0．01。

2．3 HBD-2 mRNA和TNF-α mRNA的表達(dá)在銀屑病患者重度組顯著高于中度和輕度組(P＜0．01);中度組高于輕度組(P＜0．01)。見表2。

2．4 在銀屑病皮損中HBD-2 mRNA及TNF-α mRNA的表達(dá)均與患者的PASI評分成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 r=0．89、r=0．79;P 值均 ＜0．01。

3 討論

銀屑病的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，近年來多認(rèn)為銀屑病是免疫介導(dǎo)的疾病，促炎因子如TNF-α、IL-1等在銀屑病的發(fā)病中扮演著重要的角色。Grone等［4］研究發(fā)現(xiàn) TNF-α 刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增殖;并誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)，為中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞提供粘附位點(diǎn)，活化中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞，釋放炎性介質(zhì)，加劇局部的炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生典型銀屑病皮損［5］。

表1 對照組、非皮損組及皮損組HBD-2、TNF-α mRNA表達(dá)(x±s)Tab．1 The mRNA expression of HBD-2 and TNF-α in lesional skin，noninvolved skin and normal controls(x±s)

表2 輕度組、中度組及重度組HBD-2、TNF-α mRNA表達(dá)(x±s)Tab．2 The mRNA expression of HBD-2 and TNF-α in mild group，moderate group and severe group(x±s)

銀屑病患者皮膚屏障功能嚴(yán)重受損但卻很少發(fā)生感染，其原因之一就是Schroder等［6］在銀屑病皮損中發(fā)現(xiàn)的HBD-2的高表達(dá)。HBD的高表達(dá)不僅可以預(yù)防感染，可能和銀屑病的發(fā)病也存在著某種密切的關(guān)系，Hollox等［7］對銀屑病患者和正常對照的8號染色體的HBD區(qū)域進(jìn)行基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)HBD-2基因的拷貝數(shù)與銀屑病的發(fā)生呈正相關(guān)。

HBD-2可被多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生。Joly等［8］用 IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、IFN-γ 和LPS刺激牙齦角質(zhì)形成細(xì)胞，對其表達(dá)的HBD-2進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)其中TNF-α和IL-1β是導(dǎo)致HBD-2的表達(dá)最主要原因。Gambichler等［1］發(fā)現(xiàn)銀屑病患者經(jīng)依那西普(TNF-α受體阻滯劑)治療后PASI評分及皮損中HBD-2較治療前明顯下降，認(rèn)為依那西普誘導(dǎo)的銀屑病病變的改善與HBD-2等表達(dá)明顯下降有關(guān)。而研究表明HBD-2又可反過來刺激TNF-α的產(chǎn)生。Kanda等［9］研究發(fā)現(xiàn) HBD-2可作為刺激因子，通過JNK等途徑促進(jìn)TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本研究表明:HBD-2和TNF-α在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá)均升高，且HBD-2和TNF-α存在正相關(guān)，并且二者的表達(dá)隨銀屑病患者病情嚴(yán)重程度的增加而增加，和銀屑病PASI評分成顯著的正相關(guān)。常玉英等［10］研究表明 HBD-2的高表達(dá)與TNF-α共同作用可加劇炎癥反應(yīng)，以及本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果推測:作為固有免疫和獲得性免疫的橋梁的HBD-2和TNF-α之間可能存在著相互作用，相互誘生的關(guān)系。HBD-2的高表達(dá)是一把雙刃劍在防御感染的同時，也可能擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，與TNF-α等促炎因子共同參與了銀屑病的發(fā)病過程。

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