胡 俊 陳旭輝 吳 軍 (北京大學(xué)深圳醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 深圳 518035)

重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)是絲氨酸蛋白酶家族的一員，主要作用是激活纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶。rt-PA對血栓的選擇性高，半衰期短，無抗原性，是迄今為止唯一被美國FDA批準(zhǔn)用于急性腦梗死的溶栓藥物，可溶解血栓，早期開通閉塞的血管，恢復(fù)血供，減少腦組織損傷。歐美國家相繼開始了rt-PA靜脈溶栓治療急性腦梗死的大規(guī)模、多中心、隨機(jī)對照實驗〔1，2〕。但是，由于rt-PA靜脈溶栓治療時間窗只有3 h，極大地限制了其在臨床上的應(yīng)用。近年有研究表明，rt-PA除了參與溶栓過程之外，還可能參與血腦屏障(BBB)后期的血管生成、神經(jīng)生成和軸突再生〔3，4〕。本研究擬探討rt-PA對BBB氧糖剝奪(OGD)后神經(jīng)細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、rt-PA、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、小牛血清(FCS)、胰蛋白酶、馬血清、考馬斯亮藍(lán)、甘氨酸、丙烯酰胺、MTT、相差倒置顯微鏡、振蕩器、酶聯(lián)免疫檢測儀、紫外可見分光光度計TU-1810D等。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞株用含有10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞呈菱形。當(dāng)細(xì)胞接近70%～80%融合時以0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化液消化后傳代。HUVEC細(xì)胞濃度取2×105/ml用于各項實驗。

1.2.2 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng) 海馬神經(jīng)元取自C57BL/6新生鼠，75%乙醇消毒，取出大腦置于冷的Hanks平衡鹽溶液中，迅速剝離分出兩側(cè)海馬組織，轉(zhuǎn)移至0.25%的胰酶中37℃消化15 min。血清終止消化，1 500 r/min，4℃離心10 min以沉降組織。用冷的10%DMEM清洗組織一次，離心后重懸，吹打使組織成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml。接種于多聚鳥氨酸處理的培養(yǎng)瓶、24孔板與96孔板中。培養(yǎng)第2天將DMEM培養(yǎng)液換成神經(jīng)元培養(yǎng)液，每周換液兩次。

1.2.3 BBB的建立 利用24孔Transwell培養(yǎng)小室，在培養(yǎng)HUVEC之前，用0.5%明膠包被3 μm孔徑的薄膜，HUVEC細(xì)胞與含有10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液中加入含40%培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞后的培養(yǎng)液混合在一起進(jìn)行BBB的血管上皮細(xì)胞培養(yǎng)，使其產(chǎn)生和維護(hù)BBB的特性，培養(yǎng)24 h后單個細(xì)胞形成單層細(xì)胞。

1.2.4 OGD實驗 將惰性混合氣體(5%CO2+95%N2)供應(yīng)裝置連接到轉(zhuǎn)移箱的閥門上，激活轉(zhuǎn)移箱泵的微調(diào)開關(guān)以抽真空，當(dāng)手套伸進(jìn)手套箱并稍微觸及箱體底部時，關(guān)閉真空泵，打開氣閥輸入混合氣體。將溫度設(shè)定在37℃，預(yù)熱0.5 h，待用。

1.2.5 rt-PA對神經(jīng)元活性的作用 調(diào)整神經(jīng)元細(xì)胞濃度為2×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，加入rt-PA，使其濃度分別為:40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μg/ml，分別加入到神經(jīng)元細(xì)胞中，100 μl/孔，每個rt-PA藥物濃度設(shè)4個平行孔，同時設(shè)細(xì)胞對照，置厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 h;另外一組以同樣方式每個rt-PA藥物濃度設(shè)4個平行孔，同時設(shè)細(xì)胞對照，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 h，用MTT法進(jìn)行檢測，每孔加入噻唑藍(lán)(MTT)溶液 5 mg/ml、加入 150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度，記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析，計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

在無氧糖剝奪(non-OGD)條件下，高濃度rt-PA(40、20、10、5 μg/ml)對神經(jīng)細(xì)胞有毒性作用;而低濃度 rt-PA(0.312 5 μg/ml)對神經(jīng)細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用，與細(xì)胞對照組比較有顯著差異(P＜0.01)。

在 OGD 條件下，除高濃度 rt-PA(40、20、10、5 μg/ml)對神經(jīng)細(xì)胞有毒性作用外，低濃度 rt-PA(0.625、0.312 5 μg/ml)對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，與OGD條件的細(xì)胞對照比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

為更能說明rt-PA對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，把在OGD和non-OGD條件下，rt-PA對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.25、0.625、0.312 5 μg/ml三個濃度均無顯著差異(P＞0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度rt-PA對厭氧與非厭氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞活性影響比較

3 討論

rt-PA是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并儲存及釋放的一種絲氨酸蛋白酶，主要的生物學(xué)功能是激活纖溶酶原轉(zhuǎn)變成纖溶酶，纖溶酶將纖維蛋白及血漿凝血因子(如因子Ⅴ、Ⅷ)降解，從而使血管再通。對于rt-PA治療缺血性腦梗死的利弊，目前仍有諸多爭議，有的觀點認(rèn)為rt-PA在溶解血栓之后，會進(jìn)一步影響B(tài)BB的功能，并且導(dǎo)致BBB通透性的開發(fā)，例如通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、N-甲基-O-天冬氨酸(NMDA)受體等，引發(fā)腦出血、腦水腫的發(fā)生。還有學(xué)者認(rèn)為rt-PA具有神經(jīng)毒性作用:①rt-PA通過作用于NMDA型谷氨酸受體型亞基(NRⅠ)，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流的增加，引起神經(jīng)細(xì)胞的破壞，并促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡〔5，6〕。②rt-PA激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，特別是激活大量的MMP-9，MMP-9通過降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和血管基底膜，導(dǎo)致BBB的破壞，引起腦水腫和腦出血〔7〕。③rt-PA誘導(dǎo)低密度脂蛋白受體相關(guān)性蛋白(LRP)的激活，引起B(yǎng)BB的開放，通透性增加。另外，關(guān)于rt-PA劑量的選擇，也一直存在著矛盾，歐美建議急性腦梗死靜脈溶栓治療使用0.9 mg/kg，而根據(jù)亞洲人群的體質(zhì)，也有觀點建議使用0.6 mg/kg〔8〕。而本研究發(fā)現(xiàn)，rt-PA在高濃度對神經(jīng)細(xì)胞具有毒性作用，而在低濃度時，無論在OGD或者非OGD條件，rt-PA對神經(jīng)細(xì)胞都有保護(hù)作用。但rt-PA在BBB氧糖剝奪體外模型中對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，目前仍甚少研究。有研究認(rèn)為rt-PA通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑修整細(xì)胞的凋亡程序，從而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用〔9〕。但進(jìn)一步的研究仍需更多的努力。

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