杜廣芬，蔡志華，王 剛，代 斌，何 林

新疆兵團(tuán)化工綠色過程重點實驗室/石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆石河子 832000

黃芪(Radix Astragali)為豆科草本植物蒙古黃芪、膜莢黃芪的根，是常用的中藥材，其具有補(bǔ)氣固表、利水退腫、托毒排膿等多種療效。在我國，黃芪主要分布于東北、華北、西北和西南地區(qū)。黃芪中含有多糖、皂甙、黃酮、氨基酸等多種活性成分［1-3］，具有較高的藥用價值。目前，已從黃芪及其同屬植物中分離出10多種多糖［4］、100多種黃酮類化合物和40多種皂甙類成分。研究表明，黃芪多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、強(qiáng)心降壓、降血糖、抗應(yīng)激、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗氧化等多種藥理功效［5，6］。黃芪多糖過去大都采用水煎煮法提?。?］，近年相關(guān)研究主要集中在利用微波［8-12］或超聲波［13-15］輔助提取等較為高效的提取方法。但文獻(xiàn)報道的各種方法均存在提取時間長、多糖得率不高［16，17］等不足。因此，發(fā)展更加快捷高效的提取方法具有重要的應(yīng)用價值。超聲-微波協(xié)同提取法［18-22］是一種先進(jìn)的萃取手段，該方法將微波和超聲兩種手段有機(jī)結(jié)合起來，大大提高了提取效率。本實驗在黃芪多糖水浸提法提取的基礎(chǔ)上，以多糖得率及粗多糖純度為目標(biāo)函數(shù)，對黃芪多糖的微波-超聲協(xié)同提取進(jìn)行了研究。

1 材料與儀器

原料:黃芪，經(jīng)分析符合中華人民共和國藥典2005年版一部“黃芪”項下有關(guān)規(guī)定。98%硫酸、苯酚、95%乙醇、葡萄糖均為分析純。

主要儀器:CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取/反應(yīng)儀(上海新拓分析儀器有限公司);UV22501PC型紫外可見分光光度計(日本島津公司);BS 124S電子分析天平。

2 實驗方法

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

2.1.1 葡萄糖標(biāo)液配置:精密稱取0.1087 g葡萄糖定容至1000 mL容量瓶中加蒸餾水稀釋至刻度線。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確吸取葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 于 10 mL試管中，統(tǒng)一用蒸餾水稀釋至2 mL，再各加入5%的苯酚1 mL，迅速滴加5 mL濃硫酸，搖勻，室溫下放置30 min，以加入葡萄糖貯備液0.0 mL組作為空白液，進(jìn)行空白試驗。

2.1.3 最大吸收波長的選擇:取配置的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液2 mL，加入5% 的苯酚1 mL，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，室溫顯色30 min，冷卻，在波長為200～600 nm范圍內(nèi)，用紫外可見分光光度計掃描，測得最大吸收波長為490 nm。

將上述各黃芪多糖待測液，在490 nm處測得吸光度，以吸光光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1，得回歸方程:Y=0.0119X-0.0057(R2=0.9985)。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 黃芪多糖測定方法［23］

采用苯酚-硫酸法。多糖在濃硫酸的作用下水解生成單糖，并迅速脫水形成糠醛衍生物，然后與苯酚縮合成有色化合物，在490 nm處有最大吸收。

準(zhǔn)確稱取約0.01 g粗多糖樣品，置于250 mL量瓶中，加水溶解，定容。精密吸取2 mL樣品溶液于試管中，再加入1 mL的苯酚，迅速滴加5 mL濃硫酸，搖勻，室溫下放置30分鐘，以加入葡萄糖貯備液0.0 mL組作為空白液，進(jìn)行空白試驗，在490 nm處測定吸光值。由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.0119X-0.0057計算可得黃芪多糖含量，其中Y為吸光度值，X為葡萄糖濃度(ug/mL)。

2.3 黃芪多糖提取方法

以水為溶劑浸提:準(zhǔn)確稱取5 g黃芪粉末(過20目篩)，加入10～30倍量的水，室溫下靜置60 min，在超聲波-微波協(xié)同作用下提取一段時間，趁熱過濾得提取液，提取液適當(dāng)濃縮，加入約3倍濃縮液體積的95%乙醇醇沉，靜置5 min，過濾、干燥得到黃芪粗多糖。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因子實驗

3.1.1 提取時間對黃芪多糖得率的影響

在料液比為1∶10，功率為180 W的條件下，分別控制提取時間為 60 s、90 s、120 s 、150 s、180 s提取黃芪多糖，計算提取率及純度，得圖。由實驗結(jié)果可知，150 s內(nèi)多糖提取過程基本達(dá)到平衡，增加提取時間，多糖得率變化不大，由于黃芪中其它成分的溶出，多糖純度反而呈下降趨勢。因此可以選擇120，150，180 s作為正交因子。

圖2 時間對多糖得率和純度的影響Fig.2 Effect on yield of hippophae rhamnoides polysaccharide by time

3.1.2 不同功率對黃芪多糖得率的影響

在提取時間為150 s，料液比為1∶10的情況下，在微波功率分別為60 W、120 W、180 W、240 W、300 W下，提取黃芪多糖，計算提取率及純度，得圖3。由實驗結(jié)果可知，多糖得率隨微波功率增加而增大，當(dāng)微波功率增加到120 W時，進(jìn)一步增加功率，多糖得率變化不明顯，由于其它成分的溶出，多糖純度呈下降趨勢。因此可以選擇60 W，120 W，180 W作為正交因子。

圖3 不同功率對黃芪多糖得率的影響Fig.3 Effect on yield of hippophae rhamnoides polysaccharide by different power

在提取時間為150 s，微波功率為120 W的情況下，取不同的料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 提取多糖，計算提取率及純度，得圖4。實驗結(jié)果表明，溶劑用量為20 mL/g原料較合適，進(jìn)一步增加溶劑用量，提取率下降明顯，這可能是因為過多的溶劑增加了多糖的溶解，使析出的多糖減少。因此可以選擇 1∶15、1∶20、1∶25 作為正交因子。

圖4 不同料液比對沙棘多糖得率的影響Fig.4 Effect on yield of hippophae rhamnoides polysaccharide by different rate of solid to liquid

3.2 正交試驗

綜合上述單因素實驗結(jié)果，以超聲波-微波協(xié)同提取時間、微波功率和料液比作為正交因子，設(shè)計了3因素3水平正交實驗，優(yōu)選最佳工藝條件，正交實驗及方差分析結(jié)果如下:

表1 正交實驗因子水平表Table 1 The orthogonal experiment factor level table

表2 正交實驗表及結(jié)果Table 2 The orthogonal experiment table and results

表3 正交實驗結(jié)果方差分析Table 3 Orthogonal experimental results of variance analysis

通過正交實驗和方差分析可以看出，各因素對黃芪多糖提取率的影響順序為:B＞A＞C，即微波功率＞提取是間＞料液比。各因素的最佳組合為B2A2C3，即微波功率120 W，提取時間150 s，料液比1∶25(g/mL)時，在此最優(yōu)條件下，黃芪多糖的提取率最高可達(dá)4.25%。

3.3 最佳工藝驗證實驗

取同一批次藥材按最佳提取工藝條件進(jìn)行提取，分別提取三批，結(jié)果如下(表四)所示，平均提取率為4.162%，RSD 為1.938;平均純度為 68.433%，RSD 為0.276。

表4 驗證實驗Table 4 Demonstration test

3.4 最佳工藝驗證實驗

將超聲-微波協(xié)同提取法與文獻(xiàn)報道的水提法［7］、微波輔助法［8］、超聲輔助法［13］進(jìn)行平行提取實驗，對提取率及多糖純度進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，利用超聲-微波協(xié)同提取法可以獲得更高的多糖提取率及更優(yōu)的多糖純度(圖5)。

圖5 黃芪多糖不同提取方法的比較Fig.5 Comparison of different extraction methods of astragalus polysaccharides

4 結(jié)論

通過以上實驗得出黃芪多糖超聲波-微波協(xié)同提取的最佳工藝為:微波功率120 W、提取時間150 s、最佳料液比為1∶25(A2B2C3)，黃芪多糖提取率為4.245 mg/g。結(jié)果表明，超聲-微波協(xié)同提取法與其他方法相比，更加省時、高效，所得多糖純度更高。

1 He ZJ(賀珍俊)，Na RS(那日蘇).Review on the research of astragalus polysaccharides extract technology.Inner Mongolian Petrochemical Industry(內(nèi)蒙古石油化工)，2003，23(1):5-6.

2 Sun WJ(孫文基)，Zhang DK(張登科)，Dang ZW(黨治穩(wěn)).Extraction and preparation of natural ingredient(天然藥物成分提取與制備).Beijing:Chinese medical science and technology press，1994.33.

3 Li HM(李紅民)，Huang RQ(黃仁泉).Research on yield increase of technology of astragalus polysaccharides extract.Sci J Northwest Univ(西北大學(xué)學(xué)報，自科版)，2000，30:509-510.

4 Yan QJ(閻巧娟).Extraction and separation of the active protein of Mongolia astragalus polysaccharides，saponins.Beijing:China Agricultural University(中國農(nóng)業(yè)大學(xué))，PhD.2005.

5 Huang Z(黃楨).Research progress on pharmacology of astragalus polysaccharides.Chin J Clin Pharm(中國臨床藥學(xué)雜志)，2002，11:315.

6 Yuan LC(袁利超)，Cheng YA(程延安)，Chen YR(陳云茹).Studied on inhibitation of rats liver cancer about Emodin，Astragalus polysaccharides.The Chinese Modern Medicine Journal(中華現(xiàn)代內(nèi)科學(xué)雜志)，2004，1:391.

7 Ni Y(倪艷)，Su Q(蘇強(qiáng)).Research on optimization experiment of astragalus polysaccharides water frying extraction process.China J Chin Mat Med(中國中藥雜志)，1998，23(5):284-286.

8 Zhao FC(趙鳳春)，Jiang YZ(蔣艷忠).Research on microwave extraction technology of astragalus polysaccharides.Lishizhen Med Mat Med Res(時珍國醫(yī)國藥)，2009，20:912-913.

9 Chen T(陳濤)，Li J(李進(jìn))，Chu ZG(褚治德)，et al.Research on microwave extraction technology of astragalus medicinal materials.Lishizhen Med Mat Med Res(時珍國醫(yī)國藥)，2009，20:349-350.

10 Gong SX(龔蘇曉)，Gao Z(高展)，Zhang TJ(張鐵軍)，et al.Microwave-assisted extraction astragalus polysaccharides and the content determination.Lishizhen Med Mat Med Res(時珍國醫(yī)國藥)，2009，19:784-786.

11 Wang L(王莉)，Liu ZY(劉志勇)，Lu JJ(魯建江)，et al.Astragalus polysaccharides microwave extraction and the content determination.Acta Chin Med Pharm(中醫(yī)藥學(xué)報)，2001，29(6):35-36.

12 Gong SZ(龔盛昭)，Yang ZR(楊卓如).Research on technology of microwave-assisted extraction astragalus polysaccharides.Journal of South China University of Technology(華南理工大學(xué)學(xué)報)，2004，32(8):93-96.

13 Jin RC(金汝城)，Zhou ST(周術(shù)濤)，Zhang D(張東).E-ven design optimization ultrasonic extraction of astragalus polysaccharides.J Anhui Agri Sci(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2009，37.5498-5499.

14 Lv BY(呂幫玉)，Xu DS(徐東生)，Tian CY(田春元)，et al.Research on technology of ultrasonic extraction astragalus polysaccharides.China Feed(中國飼料)，2009，9，37-39.

15 Zhang JL(張佳蘭).Research on technology of ultrasonic-assisted soaks raises of astragalus polysaccharides.J Agric Products Processing(農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊)，2008，7.109-111.

16 Li SZ(李樹珍)，Bai HX(白紅霞)，Bai WG(白衛(wèi)國).Comparison in different extraction technology of astragalus polysaccharides.Chinese herbal medicine(中草藥)，1995，26:408-410.

17 Han ZX(韓真賢)，Zhang Y(張宇)，Zhang YJ(張云杰)，et al.Comparison in three extraction technologies of astragalus polysaccharides.Heilongjiang Medicine and Pharmacy(黑龍江醫(yī)藥科學(xué))，2009，32(4):72-73.

18 Luo F(羅鋒)，Wang HB(汪河濱)，Yang L(楊玲)，et al.Research on ultrasound-microwave extraction method with licorice extract flavonoids.Food research and development(食品研究與開發(fā))，2006，27:127-128.

19 Zhao XL(趙小亮)，Bai HJ(白紅進(jìn))，Wu CY(吳翠云)，et al.Ultrasound-microwave extraction DuLi collaborative extraction fruit polysaccharide.Lishizhen Med Mat Med Res(時珍國醫(yī)國藥)，2007，18:2151-2152.

20 Liu ZL(劉澤龍)，Zhang LF(張連富).Studied on Ultrasound microwave collaborative extraction(UMAE)of tomatoes lycopene.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2008，20:1055-1059.

21 Yang GE(楊國恩)，Bu LT(卜麗婷)，Chen F(陳福).Ultrasound-microwave extraction solvent method with auxiliary or tree fruit of flavonoid compounds.Spectrum laboratory(光譜實驗室)，2010，27:27-31.

22 Wang GW(王國衛(wèi))，Cao ZM(曹自明)，Du GF(杜廣芬)，et al.Studied onUltrasonic-microwave extraction seabuckthorn collaborative polysaccharides.J Anhui Agri Sci(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2010，38:15555.

23 Dong Q(董群)，Zheng LY(鄭麗伊)，F(xiàn)ang JN(方積年).Research on improved phenol hydrate-sulfuric polysaccharide and sugar content determination.chinese pharmaceutical journal(中國藥學(xué)雜志)，1996，31:550-553.