嚴(yán)菊芬，王素萍，齊寧波，陳 君，毛 俊，楊樹林

南京理工大學(xué)生物工程研究所，南京 210094

我國(guó)幅員遼闊，氣候多樣，中草藥植物種類繁多，擁有世界上最豐富的藥用植物物種資源，目前有記載的藥用植物11 146種［1］。但由于中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展導(dǎo)致藥用植物的過度利用，有相當(dāng)一部分珍稀藥用植物資源瀕臨滅絕。

“內(nèi)共生理論”認(rèn)為內(nèi)生真菌可產(chǎn)生與其宿主相同或相似的代謝物質(zhì)［2］，因此從一些藥用植物中分離某些內(nèi)生菌，利用內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒的天然活性物質(zhì)來代替藥用植物，這樣不但很好地保護(hù)了中草藥植物資源，而且也為新藥物的開發(fā)利用提供了新的途徑，具有極大的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)潛力。本文就藥用植物內(nèi)生真菌宿主植物的選擇，內(nèi)生真菌分離及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的制備、分離純化和活性研究進(jìn)行綜述，以期為藥用植物內(nèi)生真菌研究者提供方法和思路。

1 內(nèi)生真菌宿主植物的選擇

世界上藥用植物種類很多，選取何種植物材料來分離內(nèi)生真菌并進(jìn)行相應(yīng)的研究是一個(gè)非常重要的問題。有的內(nèi)生真菌不但可以自身合成藥物活性成分，還具有促進(jìn)宿主植物合成活性成分的能力。例如，Wang et al.［3-5］從中國(guó)紅豆杉(Taxus chinensis)中分離到的一株內(nèi)生真菌，可使紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的紫杉醇產(chǎn)量提高兩倍，這對(duì)于天然藥物的研究具有特別的意義。Strobel et al.［6］在選擇植物進(jìn)行內(nèi)生菌分離及發(fā)現(xiàn)其天然產(chǎn)物中提出了以下幾個(gè)基本原則:

1.1 選擇特殊環(huán)境中的植物，尤其是那些具有獨(dú)特生物特征及生存方式的植物。通常認(rèn)為處于特殊環(huán)境中的植物可能是產(chǎn)新活性化合物的內(nèi)生菌的來源。

紅樹林是生長(zhǎng)于熱帶和亞熱帶陸海交界帶上的稀有木本植物，是由陸地向海洋過渡的特殊生態(tài)系統(tǒng)，因而其內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物也成為天然產(chǎn)物研究的一個(gè)熱點(diǎn)。如近十多年來先后從紅樹林內(nèi)生真菌Halascus kanaloanus中分離得到了helascolides A和B、赭曲霉素、Meomangicol A ～C、Pilifonnie acid、異香豆素Avicennin A和B及其類似物、三羥基麥角甾醇、鞘胺醇苷等化合物［7-8］。

1.2 選擇民間傳統(tǒng)藥用植物。對(duì)這些植物的了解一般通過與當(dāng)?shù)鼐用窠涣骰蚴俏墨I(xiàn)的記載。在對(duì)這些植物研究過程中，發(fā)現(xiàn)植物的治療作用與其內(nèi)生菌有關(guān)。如用于治療割傷、傷疤和感染的蛇草Kennedia nigrscans，研究發(fā)現(xiàn)其治療作用不是植物本身，而是其內(nèi)生菌鏈霉菌Streptomyces NRRL 30562產(chǎn)生的廣譜的新肽類抗生素munumbicins［9］。

1.3 選擇地域性的植物，它們具有特殊的存活方式。如岡瓦納大陸的植物比其它地方的植物寄存著更多具有產(chǎn)天然活性物的內(nèi)生真菌。

1.4 選擇生長(zhǎng)于具有生物多樣性地區(qū)的植物。通常此地區(qū)的植物內(nèi)生真菌也具有較高的生物多樣性，如目前研究比較多的雨林植物［8，10］。

2 內(nèi)生真菌分離鑒定

2.1 表面消毒

內(nèi)生真菌是生物活性次級(jí)代謝物的重要來源［11-13］，所以藥用植物內(nèi)生真菌分離是一個(gè)關(guān)鍵而重要的步驟。分離所用的方法應(yīng)能篩選出植物體內(nèi)盡可能多的內(nèi)生真菌，同時(shí)能排除表面附生的真菌。

最常用的分離方法是植物組織表面消毒法。在此過程中最重要的是消毒劑的選擇，理論上，消毒試劑應(yīng)該殺死植物表面所有微生物而不影響宿主植物內(nèi)生真菌。但一般很難做到，因?yàn)樵诒砻嫦镜耐瑫r(shí)消毒劑可能滲入植物組織而影響內(nèi)生真菌的分離。組織塊表面消毒通常包括以下步驟［14］:(1)用自來水徹底洗掉根組織上黏附的泥土顆粒、微生物或其他可溶性雜物;(2)預(yù)處理掉植物表面水不溶性物質(zhì)(如葉子表面上的蠟)，為后面消毒提供條件;(3)表面消毒除去植物組織表面微生物;(4)無菌條件下用無菌水沖洗多次;(5)無菌檢查，確保植物組織表面完全無菌，這是分離內(nèi)生真菌的關(guān)鍵。

常用的消毒試劑有NaClO、乙醇和H2O2，從環(huán)保和健康角度講，HgCl2、甲醛、丙烯氧化物、AgNO3等在內(nèi)生真菌分離中較少使用。在實(shí)際分離過程中，一般將多種消毒劑聯(lián)合使用提高表面消毒的效力。如將表面活性劑(如Tween-80或曲通X-100)和消毒劑結(jié)合使用，消毒后將組織在無菌水或70%～95%的乙醇中浸泡1 min以除去殘留的消毒劑。常用的消毒劑和使用條件列在表1中。

表1 表面消毒試劑和方案Table 1 The reagents and programs of surface disinfection

除組織表面消毒法分離內(nèi)生真菌外，還有真空或壓力提取法。Cohen［26］利用大型真空過濾器從植物葉組織中分離內(nèi)生真菌;Hallmann et al.［27］使用Scholander壓力泵分離內(nèi)生真菌。這些方法排除了消毒劑的影響，但需要特殊的設(shè)備，操作不方便，應(yīng)用不廣泛。

為了保證分離的真菌是內(nèi)生的，必須要對(duì)植物組織表面消毒效果進(jìn)行檢查。檢查方法有(1)組織印跡法:將消過毒的植物組織表面印跡于培養(yǎng)基上［28］;(2)漂洗液檢驗(yàn)法:將最后沖洗材料的液體涂布于培養(yǎng)基上［29］;(3)組織浸漬法:將消過毒的植物組織浸漬在液體培養(yǎng)基中［30］。如果培養(yǎng)基上沒有微生物生長(zhǎng)，說明表面消毒徹底。

2.2 分離培養(yǎng)基

內(nèi)生真菌分離用的培養(yǎng)基有馬丁培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、察氏瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、牛肉浸汁(血)瓊脂、曲汁培養(yǎng)基、Pfeffer液體培養(yǎng)基、Sabouraud瓊脂培養(yǎng)基、玉米粉瓊脂和燕麥粉瓊脂等［31］。分離藥用植物材料樣品多用察氏瓊脂或PDA培養(yǎng)基等［32］。為了分離宿主植物特定的內(nèi)生真菌，有時(shí)需用營(yíng)養(yǎng)貧乏的培養(yǎng)基如合成低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(SNA)和康乃馨葉片培養(yǎng)基(CLA)［33］;為了提高分離的真菌種類多樣性，往往對(duì)同一組織在多種不同培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)，在真菌分離培養(yǎng)過程中，通常在培養(yǎng)基中添加選擇性生長(zhǎng)抑制劑(如兩性霉素B)和抗生素(如氨芐青霉素)用來延緩和抑制某些菌的生長(zhǎng)［34］。

2.3 內(nèi)生真菌的鑒定

內(nèi)生真菌的鑒定通常根據(jù)群體和個(gè)體形態(tài)特點(diǎn)進(jìn)行歸類與鑒定，肉眼觀察菌落大小、顏色、表面特征、質(zhì)地和生長(zhǎng)速度等，光學(xué)顯微鏡或電子掃描電鏡(SEM)觀察個(gè)體形態(tài)的菌絲、子實(shí)體、孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征，然后根據(jù)真菌鑒定手冊(cè)［35，36］進(jìn)行歸類。對(duì)于那些在純培養(yǎng)中既不能生長(zhǎng)也不能形成孢子的真菌，就要采用其他方法進(jìn)行鑒定，如rDNA序列測(cè)定。

3 發(fā)酵

藥用植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生活性物一般通過微生物發(fā)酵法。在此過程中，生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生和產(chǎn)量在不同的發(fā)酵培養(yǎng)基以及不同的發(fā)酵方式下會(huì)存在很大的差異，因此選擇合適的培養(yǎng)基種類和發(fā)酵方式顯得非常重要。

發(fā)酵方式根據(jù)培養(yǎng)基狀態(tài)可分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵;根據(jù)發(fā)酵位置可分為表面發(fā)酵和深層發(fā)酵;根據(jù)所用菌種數(shù)量可分為單一純種發(fā)酵和混合發(fā)酵;根據(jù)發(fā)酵是間歇的還是連續(xù)的分為分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，各種發(fā)酵方式往往是組合進(jìn)行的，選擇什么樣的組合方式取決于菌種的特性、原料特點(diǎn)、產(chǎn)物特色、設(shè)備狀態(tài)、技術(shù)可行性、成本核算等方面的因素［37］。郭志勇［38］通過實(shí)驗(yàn)室靜置發(fā)酵技術(shù)，從紅樹林內(nèi)生真菌 Paecilomyces sp.(tree l-7)的次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到十六個(gè)化合物，兩個(gè)新化合物，paecilin A，B;林挺［39］從內(nèi)生真

圖1 微生物代謝物分離的一般工藝過程［41］Fig.1 The general separation process of microbial metabolites

菌Phomopsis sp.XZ26的液體發(fā)酵和固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離并鑒定了14個(gè)化合物;李春遠(yuǎn)等［40］將混合發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于南海紅樹林內(nèi)生真菌E33和K38代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)，從該提取物中分離到5個(gè)化合物，其中，3個(gè)化合物在以往分離的海洋真菌中鮮見報(bào)道。

4 產(chǎn)物分離純化

研究藥用植物內(nèi)生真菌的主要目的是從其代謝產(chǎn)物中分離得到單一組分。但其發(fā)酵液成分較為復(fù)雜，需選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑵渲兴鞣N成分逐一分開，這也是進(jìn)行理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)表征及其生物功能和活性等后續(xù)研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。內(nèi)生真菌發(fā)酵液的一般分離過程如圖1所示。

在研究藥用植物內(nèi)生真菌活性代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)之前必須進(jìn)行純度測(cè)定。純度測(cè)定時(shí)，首先觀察其是否形態(tài)完整、色澤均一、氣味一致等，再用常用的純度測(cè)定方法:(1)TLC:TLC是一種微量、快速的層析方法，單一化合物在TLC中表現(xiàn)為單一斑點(diǎn)。但用TLC做純度檢測(cè)時(shí)，不僅需要3種不同極性展開系統(tǒng)展開，還要選擇三種分子間作用力不同的溶劑系統(tǒng)，分別展開來確定組分是否為單一斑點(diǎn);(2)熔點(diǎn):任何純凈的固體有機(jī)物均有一恒定的熔點(diǎn)，且熔點(diǎn)距一般不超過l℃，所以通過測(cè)定化合物熔點(diǎn)，根據(jù)其熔點(diǎn)范圍可以判斷未知固態(tài)有機(jī)物純度;(3)HPLC:化合物在HPLC中表現(xiàn)為單一峰，一般判斷其為純品;(4)MS:特點(diǎn)是只給出化合物的準(zhǔn)分子離子峰，通過正負(fù)離子的相互作用來確定分子量。如果樣品不純，就會(huì)檢出多對(duì)準(zhǔn)分子離子峰，不但確定了純度，還能明確混雜物的分子量;(5)NMR:從氫譜中如果發(fā)現(xiàn)有很多積分不到一的小峰，就有可能是樣品中的雜質(zhì)。利用門控去偶的技術(shù)通過對(duì)碳譜的定量也能實(shí)現(xiàn)純度鑒定。

5 生物活性研究

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康难芯績(jī)?nèi)生真菌代謝產(chǎn)物活性，在研究中至少需要特別注意兩個(gè)方面［42］:一是盡可能對(duì)發(fā)現(xiàn)的活性或沒有發(fā)現(xiàn)活性的信息進(jìn)行較全面的評(píng)價(jià)，做出準(zhǔn)確判斷，避免因低水平重復(fù)造成不必要的浪費(fèi);二是要進(jìn)行樣品的適當(dāng)積累，實(shí)現(xiàn)樣品生物活性的長(zhǎng)期利用，從多個(gè)生物學(xué)和藥理學(xué)內(nèi)容進(jìn)行生物活性篩選，發(fā)現(xiàn)其可能存在的生物活性，實(shí)現(xiàn)資源的充分利用。

6 藥用植物內(nèi)生真菌研究存在的問題與展望

我國(guó)藥用植物種類豐富，但受植物資源生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低等限制，很難滿足人類的需要。藥用植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的多樣性以及其抗菌、抗腫瘤等活性的發(fā)現(xiàn)，為解決部分藥物供不應(yīng)求的現(xiàn)狀提供了新的途徑。藥用植物內(nèi)生真菌的研究雖然取得一定的成績(jī)，但還存在一些問題:

(1)在內(nèi)生真菌分離過程中，即使用不同的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物組織，也不能保證所有生活在植物組織內(nèi)的真菌全被分離出來;(2)藥用植物內(nèi)生真菌通過發(fā)酵生產(chǎn)活性天然產(chǎn)物的產(chǎn)量較低、分離純化難度較大，目前大多還停留在實(shí)驗(yàn)室的搖瓶階段，沒有實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn);(3)從藥用植物中篩選出的內(nèi)生真菌都是野生型菌株，性狀不太穩(wěn)定，因此需要對(duì)其進(jìn)行全面研究或遺傳改造。本實(shí)驗(yàn)室以從藥用植物溫莪術(shù)根部篩選出的活性內(nèi)生真菌EZG0807為出發(fā)菌株，利用超導(dǎo)磁體模擬空間微重力、高磁場(chǎng)環(huán)境對(duì)其進(jìn)行誘變，以期得到遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)突變菌株［43］。(4)大多數(shù)藥用植物特別是一些珍貴的藥用植物尚未開展內(nèi)生真菌方面的研究，這方面的工作需要加強(qiáng);(5)內(nèi)生真菌與宿主植物共生關(guān)系的具體機(jī)制還不清楚，需深入研究。

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