黃 漩，生慶海，，*，張志國，孫亞范

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司研發(fā)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 011500；3.乳品食品監(jiān)測中心，天津 300381）

超高壓液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測磷脂酰膽堿

黃 漩1，生慶海1，2，*，張志國2，孫亞范3

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司研發(fā)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 011500；3.乳品食品監(jiān)測中心，天津 300381）

采用超高壓液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）（配有電噴霧離子源）法檢測磷脂酰膽堿（PC），先使用氣相色譜分析可能包含的PC分子種類，再根據(jù)氣相色譜分析結(jié)果，UPLC-MS/MS進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量。UPLC的流動(dòng)相：A相為水，B相為乙腈∶甲醇=5∶5，A∶B=10∶90，流速為0.4mL/min，PC大約在4min時(shí)出峰。 最低檢出限為1μg/L，相關(guān)系數(shù)為0.99936，加標(biāo)回收率為95.6%～98.4%。

超高壓液相色譜，電噴霧質(zhì)譜，氣相色譜，磷脂酰膽堿

Abstract：The phosphatidylcholine was detected with UPLC-MS/MS （equipped with electrospray ionization source）.Gas chromatography（GC） was used to analysis PC molecular species，according to the results of GC，and then UPLC-MS/MS be used to accurate qualitative and quantitative.The mobile phase of UPLC：A，water.B，acetonitrile∶methanol=5∶5，A∶B=10∶90，had flow rate of 0.4mL/min.Under this condition，the retention time of PC was about 4min.The regression coefficient was 0.99936 and the limit of detection was 1μg/L.The recovery was in the range of 95.6%～98.4%.

Key words：Ultra Performance LC（UPLC）；electrospray ionization mass spectrometry；gas chromatography；phosphatidylcholine

磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine，PC）是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生物膜的主要組成成分，同時(shí)也是一種天然的表面活性劑，在食品、醫(yī)藥、化妝等諸多方面被廣泛的應(yīng)用[1]，隨著對(duì)卵磷脂的深入研究，卵磷脂有了狹義和廣義之分，廣義的卵磷脂包含PC、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇等，狹義的卵磷脂就是PC[2]。檢測技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，使PC的結(jié)構(gòu)更清晰，根據(jù)分子種類的不同，知道PC并不是一種單一物質(zhì)，而是許多結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)的統(tǒng)稱[3]。PC分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是一個(gè)脂?；涣姿崮憠A基所取代，磷酸膽堿基連接在甘油基的第3碳位上稱α型[4]，在自然界中存在的PC為L-α-PC。PC中磷酸基與酯化的醇部分一起構(gòu)成極性頭基，兩條長的烴鏈組成非極性尾部。甘油磷脂分子中sn-1和sn-2位上酯化的是各種組合的天然脂肪酸，一般說，PC的C1（R1CO-）位上連接的是飽和脂肪酸，主要是棕櫚酸（16∶0）或硬脂酸（18∶0）；C2（R2CO-）位上是不飽和脂肪酸，主要是18碳不飽和脂肪酸，如油酸（18∶1）、亞油酸（18∶2）和亞麻酸（18∶3）[5]。通過氣相色譜先分析出PC的C1、C2位上含哪種脂肪酸，根據(jù)PC的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析出可能存在的PC分子種類，再用質(zhì)譜進(jìn)行深入的研究，鑒定所推測的PC分子種類是否存在。質(zhì)譜檢測方法更加快速，準(zhǔn)確，保留時(shí)間在4min左右，使PC的檢測方法更加簡單。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

混合卵磷脂標(biāo)準(zhǔn)品 Fluka公司，有等量的磷脂酰膽堿、腦磷脂和磷脂酰肌醇，飽和脂肪酸24%，單不飽和脂肪酸14%，多不飽和脂肪酸62%；奶粉 不添加磷脂酰膽堿；乙腈、甲醇 默克化工業(yè)務(wù)，色譜純；氯仿、正己烷 天津市永大化學(xué)試劑有限公司，分析純；甲酯化試劑 4mol/L KOH/甲醇溶液；高純氮；工業(yè)氮。

AcQuity超高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS） 配有電噴霧離子源及MassLynx V4.1處理系統(tǒng)，美國Waters公司；GC-7890A氣相色譜 配有FID檢測器及Agilent ChemStation處理系統(tǒng)，安捷倫公司；純水儀 德國默克密理博公司；離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；振蕩器 德國IKA公司；水浴鍋 東莞市粵泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；氮吹儀北京成萌偉業(yè)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)液的配制 混合卵磷脂標(biāo)準(zhǔn)品，稱取1.0000g標(biāo)準(zhǔn)品，溶于100mL氯仿∶甲醇=9∶1（v∶v）中，濃度為10mg/mL。

1.2.2 甲酯化 甲酯化：取1mL A標(biāo)準(zhǔn)液用氮?dú)獯蹈?，加?mL正己烷溶解，再加入1mL KOH/甲醇溶液，混勻，靜置分層，取上清液上機(jī)[6]。

氣相色譜條件：色譜柱J＆W 122-1032：325℃；30m×250μm×0.25μm；載氣N2；載氣流速1.0mL/min；進(jìn)樣口溫度260℃；分流比30∶1；檢測器溫度280℃；柱溫箱溫度初始溫度140℃，保持5min，以4℃/min升溫至240℃，保持15min；進(jìn)樣量1μL[7]。

1.2.3 UPLC條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH?C18，2.1mm×100mm，1.7μm。流動(dòng)相：A為水，B為乙腈∶甲醇=5∶5，A∶B=10∶90；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧在正離子模式下，毛細(xì)管電壓3.5kV；脫溶劑氣溫度350℃；脫溶劑氣流量500L/h；離子源溫度120℃。

1.2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 各取0.4、0.8、1.0mL的標(biāo)準(zhǔn)液分別定溶于100mL的容量瓶中，得到40、80、100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。稱取奶粉10.00g共六份到燒杯中，每兩份加入一個(gè)同樣濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，加入30mL甲醇，確保甲醇完全覆蓋樣品。在45℃水浴中保溫10min，向燒杯中加入60mL氯仿，繼續(xù)保溫15min，適當(dāng)攪拌。在布氏漏斗中加兩張濾紙，過濾燒杯中的溶液到圓底燒瓶中，然后連接到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在50℃下蒸發(fā)至近干，用40mL氯仿∶甲醇=9∶1的溶液溶解，過0.22μm的濾膜，上機(jī)[8-9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過UPLC-MS/MS，用優(yōu)化的方法測得的磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品的總離子圖，見圖1。

圖1 PC標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖Fig.1 The standard spectrum of PC

在優(yōu)化的質(zhì)譜條件下，取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)作圖，見圖2，得到線性回歸方程為y=6.9300x+0.6899，相關(guān)系數(shù)0.99936，最低檢出限是1μg/L。

2.2 氣相色譜方法

圖2 不同濃度的PC標(biāo)準(zhǔn)溶液與峰面積的線性關(guān)系Fig.2 The linear relationship between different concentrations standard and peak area of PC

運(yùn)用甲酯化方法，可以推測出C1位和C2位連接的脂肪酸，因?yàn)橘|(zhì)譜檢測方法需要建立在所測樣品分子質(zhì)量已知的情況下，所以對(duì)于未知的PC樣品，應(yīng)該先進(jìn)行甲酯化，用氣相色譜檢測出標(biāo)準(zhǔn)品中所含的脂肪酸種類，見圖3。

根據(jù)PC的脂肪酸組成推測出可能存在的分子結(jié)構(gòu)，見表1。根據(jù)推測出的磷脂酰膽堿的種類，用優(yōu)化的質(zhì)譜條件進(jìn)行定性分析，檢測出該標(biāo)準(zhǔn)品中磷脂酰膽堿的種類。

表1 常見的磷脂酰膽堿分子的種類[10]Table 1 The species of common phosphatidylcholine molecular[10]

2.3 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的溶劑，文獻(xiàn)以及儀器的條件，選擇用乙腈與甲醇的配比和水作為流動(dòng)相。經(jīng)過一系列的實(shí)驗(yàn)選擇出一個(gè)合適的流動(dòng)相配比。

由圖4-A，流動(dòng)相是乙腈∶甲醇=7∶3，峰型不好，有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象；圖4-B是乙腈∶甲醇=6∶4，峰型一般，出峰時(shí)間延后；圖4-C是乙腈∶甲醇=5∶5，峰形良好，無拖尾現(xiàn)象，而且出峰快速。三個(gè)圖的對(duì)比可得出適合的流動(dòng)相為90%的乙腈∶甲醇=5∶5和10%的水。

2.4 質(zhì)譜優(yōu)化條件

圖4 對(duì)比不同流動(dòng)相的色譜圖Fig.4 The comparison of different mobile phase chromatogram

質(zhì)譜儀在建立新的方法時(shí)，需要先知道待測樣品的質(zhì)荷比（m/z），再進(jìn)行全掃描，主要選擇適合的錐孔電壓，找到響應(yīng)值最大的電壓，開啟氬氣進(jìn)行子離子的掃描，對(duì)碰撞電壓進(jìn)行修改，選擇響應(yīng)值較大且穩(wěn)定的離子作為子離子，一個(gè)子離子用作定性，另一個(gè)子離子用作定量。最后優(yōu)化出的質(zhì)譜條件，見表2。

表2 優(yōu)化的質(zhì)譜條件Table 2 The optimization of MS/MS conditions

2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

按照1.2.5的處理方法得到的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。其加標(biāo)回收率為95.63%～98.40%。

表3 加標(biāo)回收率Table 3 The recovery of standard addition

3 結(jié)論

UPLC-MS/MS法檢測PC更快速、靈敏，使PC的檢測更加簡單，再加上氣相色譜的輔助，可以深入到各種分子結(jié)構(gòu)PC的檢測，使PC產(chǎn)品的含量更加透明化，精密度和穩(wěn)定性均符合要求，此法的檢測速度符合現(xiàn)在人們對(duì)效率的高要求，更適合現(xiàn)在的社會(huì)發(fā)展趨勢。

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Method of UPLC-MS/MS about phosphatidylcholine detection

HUANG Xuan1，SHENG Qing-hai1，2，*，ZHANG Zhi-guo2，SUN Ya-fan3
（1.Food Science College of Northeast Agricultural University，Harbin150030，China；2.R&D Center，Inner Mongolia Mengniu Dairy（Group）Co.，Ltd.，Huhhot 011500，China；3.Dairy Food Monitoring Center，Tianjin 300381，China）

TS207.3

A

1002-0306（2012）16-0096-03

2012-02-09 *通訊聯(lián)系人

黃漩（1986-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。