楊曉倩，劉小鳴，周 鵬

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

前表面熒光法在牛奶美拉德反應(yīng)檢測(cè)中的應(yīng)用

楊曉倩，劉小鳴，周 鵬*

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

在熱處理中，牛奶中的乳蛋白容易與乳糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，使牛奶的色澤、風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)等發(fā)生變化。與傳統(tǒng)化學(xué)檢測(cè)法相比，前表面熒光法具有快速靈敏、前處理簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。為了評(píng)估前表面熒光法在檢測(cè)牛奶美拉德反應(yīng)程度上的準(zhǔn)確性和適用性，本文對(duì)比了不同熱處理下牛奶的美拉德反應(yīng)的熒光圖譜和美拉德產(chǎn)物的含量，分析了指標(biāo)間的相關(guān)性。并以前表面熒光法和羥甲基糠醛含量建立模型對(duì)商業(yè)乳品進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果良好，為熒光檢測(cè)的工業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示，前表面熒光法可應(yīng)用于牛奶前中期美拉德產(chǎn)物的無損檢測(cè)。

前表面熒光，美拉德反應(yīng)，化學(xué)計(jì)量學(xué)，牛奶

Abstract：Milk proteins are liable to react with lactose during thermal processing，causing changes in color，flavor and nutritional function.In order to understand the accuracy and applicability of front-face fluorescence spectroscopy，the extents of Maillard reaction of the milk samples with various degrees of heat treatments were measured by three Maillard reaction tests and front-face fluorescence spectroscopy（FFFS） respectively.A strong correlation was found between FFFS，furosine and hydroxymethylfurfural.Moreover，a good prediction of hydroxymethylfurfural concentration was got in commercial milk samples using this model.This work indicated that FFFS had the reliability and sensitivity to monitor and control the thermal processing of milk.

Key words：front-face fluorescence spectroscopy；Maillard reaction；chemometrics；milk

熱處理是液態(tài)乳制品常用的加工步驟，不僅可以延長(zhǎng)貨架期，還可以減少食源性微生物污染的可能性。雖然高強(qiáng)度的熱處理可以保證乳制品的安全，但過度的熱處理會(huì)對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)帶來負(fù)作用。液態(tài)牛奶中含有豐富的乳蛋白，易與乳糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，在高溫下尤其劇烈。美拉德反應(yīng)一方面會(huì)導(dǎo)致牛奶的色澤、風(fēng)味變差，同時(shí)還會(huì)損失營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，增加有害物質(zhì)。常見的牛奶中美拉德反應(yīng)程度的檢測(cè)方法包括采用HPLC法測(cè)定美拉德反應(yīng)早期產(chǎn)物糠氨酸（Furosine）[1-3]，HPLC或比色法測(cè)定中期產(chǎn)物羥甲基糠醛（HMF）[4]以及末期色素類產(chǎn)物濃度[5-6]和鄰苯二甲醛法（OPA法）測(cè)定游離賴氨酸的含量[7-8]等。但這些方法存在前處理麻煩耗時(shí)和易受干擾等缺點(diǎn)。熒光是一種快速靈敏前處理簡(jiǎn)單的光譜技術(shù)，近年來人們嘗試將其用來評(píng)價(jià)熱處理對(duì)乳制品的影響方面，如直角熒光法檢測(cè)牛奶在pH4.6下可溶性部分的色氨酸和美拉德高級(jí)產(chǎn)物的熒光信號(hào)[9]。近年來出現(xiàn)的前表面熒光技術(shù)可進(jìn)一步簡(jiǎn)化前處理，在乳制品檢測(cè)方面的研究包括預(yù)測(cè)乳品中糠氨酸和乳果糖含量[10]，評(píng)價(jià)前表面熒光在UHT乳檢測(cè)中的準(zhǔn)確性[11]，區(qū)別液態(tài)乳產(chǎn)地[12]等，這些都為熒光快速檢測(cè)和評(píng)價(jià)乳制品的品質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用不同熱處理程度的牛奶，在美拉德反應(yīng)前中后期中各選一個(gè)代表產(chǎn)物（糠氨酸、羥甲基糠醛、色素類），分別與前表面熒光進(jìn)行相關(guān)性分析，來評(píng)價(jià)前表面熒光的準(zhǔn)確性和適用性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴氏殺菌全脂乳 光明乳業(yè)有限公司；商業(yè)巴氏奶、UHT奶 無錫各大超市；甲醇、無水乙醇 色譜純；三氯乙酸、硫代巴比妥酸、草酸、三氟乙酸、氫氧化鈉、鹽酸 化學(xué)純；0.22μm×25mm微孔濾膜 上海興亞凈化材料廠；羥甲基糠醛（5-（Hydroxymethyl）furfural）標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma-Aldrich公司；糠氨酸（Furosine dihydrochloride）標(biāo)準(zhǔn)品 NeoMPS公司；堿性蛋白酶諾維信公司。

F-7000熒光光譜儀 日本日立公司；HWS26型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；SPE 12孔真空固相萃取裝置 EASTAK公司；UV-1200分光光度計(jì) MAPADA公司；冷凍干燥機(jī) LABCONCO公司；C18固相萃取柱 VARIAN公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同程度美拉德牛奶模型體系的制備 將牛奶按每管15mL加入耐熱試管中，加密封蓋，放入水（或油）浴鍋，水（油）沒過試管液面。加熱的時(shí)間和溫度見表1。

1.2.2 糠氨酸的測(cè)定[13]取2mL樣品（蛋白含量約為60mg）至安瓿管，加入6mL 10.6mol/L鹽酸混勻，加入4滴正辛醇消泡，真空泵抽真空5min后用酒精噴燈融管密封。110℃下消化23h后，將水解液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶，定容，過濾。取濾液過0.22μm膜，向C18柱中加入1mL濾液，之前用10mL甲醇、10mL去離子水分別潤(rùn)洗，抽干。用3mL 3mol/L鹽酸洗脫，洗脫液全部收集，避光保存。之后用Agilent 1100高效液相色譜儀進(jìn)行分析。采用Ultimate AQ C18柱（250mm×4.6mm×5μm），進(jìn)樣量為5μL，流速為1.0mL/min，柱溫設(shè)定為30℃。洗脫液采用乙腈/水/三氟乙酸（5∶95∶0.1），洗脫模式為等度洗脫。10min之后換為乙腈/水/三氟乙酸（60∶40∶0.1）沖洗柱子。檢測(cè)器采用二極管陣列，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm?？钒彼岢龇鍟r(shí)間在5.4min左右。色譜圖用軟件ChemStation積分得到峰面積。由糠氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2=0.9996）計(jì)算樣品含量。每個(gè)樣品做兩次平行。

1.2.3 羥甲基糠醛的測(cè)定[14]取5mL樣品，加入0.3mol/L草酸2.5mL，充分混勻。90℃水浴60min后，用冰水浴冷卻至4℃，加入1.25mL 80%三氯乙酸，充分混勻，靜置。4000r/min離心30min。取4mL上清液至10mL離心管，加入0.05mol/L硫代巴比妥酸1mL，充分混勻。之后40℃水浴30min，冷卻至常溫。以去離子水為空白，443nm下檢測(cè)吸光度。由HMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2=0.9998）計(jì)算樣品含量。每個(gè)樣品做兩次平行。

1.2.4 美拉德反應(yīng)程度的測(cè)定[15]采用酶解比色法來測(cè)定美拉德反應(yīng)程度。吸光度越高，美拉德反應(yīng)的最終階段生成的色素類物質(zhì)越多，即美拉德反應(yīng)越劇烈。取10mL樣品，冷凍干燥后成干粉狀。加入10mL pH8.0的磷酸緩沖溶液（10mmol/L），室溫下磁力攪拌至溶解，轉(zhuǎn)速為400r/min。加入15μL堿性蛋白酶，55℃恒溫水浴振蕩15min，加入2mL 80%三氯乙酸以沉淀蛋白和終止酶解反應(yīng)。靜置，過濾，以緩沖液為空白，420nm下測(cè)定吸光值。每個(gè)樣品做兩次平行。

1.2.5 前表面熒光檢測(cè) 取5mL樣品加入石英比色皿（10mm×18mm×45mm），放置于固體樣品支架中。測(cè)定美拉德反應(yīng)程度，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為360nm，發(fā)射波長(zhǎng)為400～600nm[12]。測(cè)定色氨酸熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為280nm，發(fā)射波長(zhǎng)為310～400nm[12]。掃描速率均為12000nm/min，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度均為5nm。光譜圖由軟件FL Solutions導(dǎo)出。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)檢測(cè)法結(jié)果

糠氨酸、羥甲基糠醛含量和顏色的變化如圖1所示?？钒彼崾敲览路磻?yīng)初期的標(biāo)志性產(chǎn)物，隨著溫度和時(shí)間增長(zhǎng)，含量逐漸增多，在105℃后期樣品中，出現(xiàn)了下降，可能是糠氨酸轉(zhuǎn)化成了更高級(jí)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。羥甲基糠醛是中期標(biāo)志性產(chǎn)物，其含量明顯低于糠氨酸，在美拉德前期的增長(zhǎng)速率緩于糠氨酸，而后期的增長(zhǎng)率快于糠氨酸。酶解比色法所測(cè)得吸光度表征美拉德反應(yīng)后期色素類物質(zhì)，吸光度值與色素類含量呈正相關(guān)。在反應(yīng)前期幾乎沒有變化，中后期呈現(xiàn)線性的增長(zhǎng)趨勢(shì)。

圖1 體系在不同溫度下加熱時(shí)的糠氨酸、羥甲基糠醛含量酶解色素吸光度值Fig.1 The concentration of furosine，HMF and absorbance of final Maillard reaction products of different heating temperatures

2.2 熒光信號(hào)的變化

牛奶美拉德反應(yīng)熒光圖譜如圖2所示。隨著溫度和時(shí)間的增長(zhǎng)，樣品中的美拉德反應(yīng)程度越來越高。將熒光圖譜標(biāo)準(zhǔn)化后，在發(fā)射波長(zhǎng)400～600nm的掃描過程中，樣品會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)峰，分別在430nm和520nm處。430nm處對(duì)應(yīng)是美拉德反應(yīng)中所產(chǎn)生的熒光物質(zhì)的熒光信號(hào)，在0min的樣品中，此處幾乎沒有熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)進(jìn)行，美拉德產(chǎn)物增多，信號(hào)逐漸增強(qiáng)。隨著反應(yīng)劇烈程度的增加，在90和105℃的后期，有熒光信號(hào)減弱并伴隨最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移的現(xiàn)象。520nm處對(duì)應(yīng)是牛奶中核黃素的熒光信號(hào)[16]，表征牛奶中維生素B2的含量。顯示在三個(gè)溫度下，核黃素在初始時(shí)在525nm處有比較明顯的峰，但后期隨著美拉德熒光信號(hào)的增強(qiáng)，峰型已不明顯，但信號(hào)強(qiáng)度沒有大的變化。這個(gè)現(xiàn)象符合核黃素具有較好耐熱性。牛奶色氨酸熒光圖譜（未圖示）中熒光信號(hào)峰出現(xiàn)在340nm左右。在75℃下加熱到8h才有比較明顯的熒光信號(hào)下降，而在90℃下加熱到2h熒光信號(hào)就開始明顯下降，105℃下2.5h之后色氨酸的熒光信號(hào)只有初始的一半了。色氨酸的熒光信號(hào)表征乳蛋白受熱后的變性程度。因?yàn)槿榈鞍资怯杉s20%乳清蛋白和80%的酪蛋白所組成，乳清蛋白的變性溫度為70℃左右（beta-lactoglobulin＞70℃，alpha-lactalbumin為65～70℃）[17]，酪蛋白變性溫度在75℃以上[17]，所以在75℃下大部分的酪蛋白還能夠保持活性。

圖2 體系在不同溫度下加熱時(shí)的美拉德反應(yīng)熒光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of Maillard reaction products in different heating temperatures

將三個(gè)溫度樣品的熒光譜圖用Unscrambler軟件進(jìn)行Normalize處理之后做PCA分析，其Score圖很相似，以90℃為例，如圖3（A）所示。通過Loading圖（B）判定不同溫度組中PC1所代表均為美拉德反應(yīng)（430nm），且能解釋99%以上的樣品差別。在PC1上消極端代表美拉德程度低的樣品，積極端代表美拉德程度越高的樣品。PC1上，75℃樣品熒光信號(hào)逐漸增加，而90和105℃的樣品中，后期出現(xiàn)了信號(hào)的減弱，這可能是在劇烈的加熱條件下，美拉德反應(yīng)初期或中期產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成了更高級(jí)而沒有熒光信號(hào)的物質(zhì)。而PC2經(jīng)過分析是未知的熒光信號(hào)（約在460～470nm），在90和105℃的樣品中能解釋1%的差別信息，雖然很微弱，但是說明在實(shí)驗(yàn)中劇烈的熱處理?xiàng)l件下，熒光信號(hào)在此區(qū)間的物質(zhì)會(huì)發(fā)生變化。同時(shí)能發(fā)現(xiàn)，三個(gè)溫度組的樣品在PC2上都經(jīng)歷了從積極端向消極端再回到積極端的過程。推測(cè)是多種熒光物質(zhì)的生成增長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的疊加作用。

圖3 90℃加熱組的PCA分析Score圖（A）和Loading圖（B）Fig.3 Principal component analysis similarity map（A）and factor loading（B）of Maillard reaction products of milk samples heated under 90℃

2.3 相關(guān)性分析

將樣品的熒光譜圖和化學(xué)測(cè)定的數(shù)據(jù)導(dǎo)入U(xiǎn)nscrambler軟件，進(jìn)行PLS分析，討論糠氨酸、羥甲基糠醛、酶解吸光度值（末期色素）與熒光譜圖的相關(guān)性。將由熒光圖譜所得到的真實(shí)值和預(yù)測(cè)值導(dǎo)入SPSS軟件，進(jìn)行配對(duì)樣本T檢驗(yàn)。置信區(qū)間設(shè)定為95%，其結(jié)果如表2所示。表明三組數(shù)據(jù)的p值均遠(yuǎn)大于0.05，說明兩樣本間無明顯差異，并且三組數(shù)據(jù)的均值差值和標(biāo)準(zhǔn)誤都較小，也說明預(yù)測(cè)值和真實(shí)值之間的相關(guān)性較好。

圖4 樣品熒光圖譜和糠氨酸，羥甲基糠醛含量和酶解色素吸光度值的相關(guān)性分析Fig.4 Predicted and observed furosine，HMF concentration and absorbanceofmilksamplesthatheatedunderdifferenttemperature

表2 測(cè)量值和預(yù)測(cè)值的配對(duì)樣本T檢驗(yàn)Table 2 Paired samples test of measured value and predicted value

此外，分別分析三個(gè)溫度組的真實(shí)值和預(yù)測(cè)值之間的線性關(guān)系，可以得到好的線性關(guān)系（R2＞0.9）。將所有樣品共同分析，仍具有較好的相關(guān)性（R2＞0.8），說明具有較好的預(yù)測(cè)能力。其與美拉德反應(yīng)前期產(chǎn)物糠氨酸含量的對(duì)應(yīng)性優(yōu)于與中期后期產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)性，且和低濃度的中后期產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)性優(yōu)于高濃度，在低濃度時(shí)呈現(xiàn)線性對(duì)應(yīng)，在高濃度時(shí)對(duì)應(yīng)性變差。因此在建立模型時(shí)，由軟件自動(dòng)除去離群點(diǎn)，糠氨酸模型中去除75℃ 24h、90℃ 16h、105℃ 5.5～10h加熱點(diǎn)，HMF模型去除75℃18～24h、90℃ 7～16h、105℃ 4～10h加熱點(diǎn)，色素類吸光度模型去除75℃12～24h、90℃ 4～16h、105℃ 10h加熱點(diǎn)，均為各溫度加熱后期的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。圖4為除去離群點(diǎn)后的相關(guān)性，排除差異較大的樣品點(diǎn)使得模型更加可靠，同時(shí)也說明前表面熒光法對(duì)于檢測(cè)前中期的美拉德反應(yīng)程度具有更高的適用性。在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，經(jīng)過熱處理的液態(tài)乳制品都是處于前中期的美拉德反應(yīng)階段，因此，此法有較好的對(duì)應(yīng)性和適用性。

2.4 商業(yè)奶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

用Unscrambler軟件所建立的前表面熒光法和HMF含量的模型來預(yù)測(cè)商業(yè)乳品中HMF含量，同真實(shí)值對(duì)比，探究此模型的商業(yè)應(yīng)用性。此模型的RMSEP值為0.000819，相關(guān)系數(shù)為0.915。說明這個(gè)模型是具有較好的預(yù)測(cè)能力的。因此將其應(yīng)用于國(guó)內(nèi)6個(gè)品牌30種商業(yè)奶（巴氏奶、UHT奶等）檢測(cè)，利用此模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，其HMF含量的預(yù)測(cè)值、偏差值和真實(shí)值如表3所示。

表3 商業(yè)奶HMF含量的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值（μg/mL）Table 3 The predicted and measured HMF concentration of commercial milk samples（μg/mL）

真實(shí)值在預(yù)測(cè)值±偏差值范圍內(nèi)認(rèn)為預(yù)測(cè)有效。由表3可知，除9號(hào)樣品有些許預(yù)測(cè)偏差（0.082）之外，其余樣品都可以利用熒光結(jié)果較好的預(yù)測(cè)其HMF的含量。因此可以初步證實(shí)前表面熒光法在商業(yè)乳品的檢測(cè)中是有較好的適用性和可靠性的。進(jìn)一步說明前表面熒光法在牛奶美拉德反應(yīng)檢測(cè)中是一種無需前處理、省時(shí)、準(zhǔn)確性好的無損檢測(cè)方法。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中，不同美拉德程度的牛奶分別用化學(xué)法和前表面熒光法進(jìn)行檢測(cè)，用以評(píng)估前表面熒光法在檢測(cè)液態(tài)乳體系中美拉德程度的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了前表面熒光法與前中期的美拉德程度有較好的對(duì)應(yīng)性，且將建立的前表面熒光-HMF含量模型應(yīng)用于預(yù)測(cè)商業(yè)乳品HMF含量有較好的初步結(jié)果。因此，此法具有應(yīng)用于在工業(yè)乳制品檢測(cè)的理論基礎(chǔ)。同時(shí)此法相對(duì)其他化學(xué)方法具有無損無前處理、省時(shí)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是一種能推廣應(yīng)用的檢測(cè)手段。

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Application of front-face fluorescence spectroscopy for determination of Maillard reaction in milk

YANG Xiao-qian，LIU Xiao-ming，ZHOU Peng*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

TS252.2

A

1002-0306（2012）16-0157-05

2012－02－01 *通訊聯(lián)系人

楊曉倩（1987-），女，碩士在讀，研究方向：食品結(jié)構(gòu)與物性。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30901128）。