喬茜茜，祁 英，孫建忠，劉玉梅

（新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830046）

啤酒花多糖的提取及脫蛋白工藝研究

喬茜茜，祁 英，孫建忠，劉玉梅*

（新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830046）

以超臨界液態(tài)二氧化碳萃取后的啤酒花殘渣為原料，采用正交實驗和單因素實驗，確定了啤酒花多糖的熱水微波輔助萃取的最佳工藝條件：提取時間2h，料液比1∶10，提取溫度90℃，微波功率750W作用時間12min；此條件下多糖提取率為2.76%。對得到的粗多糖，以蛋白脫除率和多糖保留率為指標(biāo)，在比較Sevag法，鹽酸-正丁醇法，三氯乙酸-正丁醇法，木瓜/菠蘿蛋白酶法對粗多糖中蛋白質(zhì)的脫除效果的基礎(chǔ)上，考察了酶法和化學(xué)法聯(lián)用脫蛋白工藝，并最終確定菠蘿蛋白酶-三氯乙酸-正丁醇的脫蛋白效果最好，最佳條件為溫度45℃，酶解時間0.5h，酶添加量22.5U/mL，pH5.5，三氯乙酸-正丁醇法除蛋白1次，蛋白脫除率和多糖保留率分別為86.77%和77.37%；而木瓜蛋白酶-鹽酸-正丁醇的脫蛋白工藝在有效脫除蛋白質(zhì)的同時，多糖損失最少，最佳條件為溫度55℃，酶解時間0.5h，酶添加量36U/mL，pH5.5，鹽酸-正丁醇法除蛋白1次，蛋白脫除率和多糖保留率分別為77.37%和84.43%。

啤酒花，多糖，提取，脫蛋白

Abstract：The hops were pre-processed which use supercritical carbon dioxide extraction as samples.The optimal extraction processing parameters were investigated by orthogonal experiments combined with single factor experiments.The best technological conditions for hot distilled water extraction by microwave-assisted was extraction time of 2h，ratio of solid-liquid 1∶10，extraction temperature of 90℃ and 750W of microwave power for 12min，and the yield of polysaccharides from hops was up to 2.76%under this condition.Protein removal rate and polysaccharide retention rate were used to evaluate and compare the effectiveness for several methods，namely Savage method，hydrochloric acid-n-butanol，trichloroacetic acid（TCA）-n-butanol，papain/bromelain method.Based on the investigation，the combinatorial method between enzymatic hydrolysis and chemical method was used to evaluate the technical of deproteinization.Bromelain-TCA-n-butanol was found to be the best method for the deproteinization of hop crude polysaccharides.The optimal operating conditions of Bromelain-trichloroacetic acid（TCA）-n-butanol method were temperature 45℃，hydrolysis time 0.5h，substrate concentration 22.5U/mL of bromelain and pH5.5 followed by once treatment with trichloroacetic acid（TCA）-n-butanol method，the amount of protein removed was 86.77%while polysaccharide remained 77.37%during the deproteinization process.But compared with the loss rate of polysaccharide，the papainhydrochloric acid-n-butanol method was better.The optimal operating conditions of papain-hydrochloric acid-n-butanol method were temperature 55℃ ，hydrolysis time 0.5h，substrate concentration 36U/mL of bromelain and pH5.5 followed by once treatment with hydrochloric acid-n-butanol method，the amount of protein removed was 77.37%while polysaccharide remained 84.43%during the deproteinization process．

Key words：hop；polysaccharides；extraction；deproteinization

啤酒花，學(xué)名蛇麻（Humulus Lupulus L.），是?？坡刹輰俣嗄曷荼局参?，主要用于啤酒釀造。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，啤酒花中除含有影響啤酒風(fēng)味質(zhì)量的揮發(fā)性成分和苦味樹脂類成分外，其中的多酚和類黃酮類物質(zhì)還具有非常重要的藥理活性作用，已從中分離和鑒定出了數(shù)百種化合物[1]，但對啤酒花中的多糖類物質(zhì)的研究相對較少。研究表明，多糖類物質(zhì)在生物體內(nèi)不僅是能量來源或結(jié)構(gòu)材料，更重要的是它參與了各種重要的生命活動，具有可與蛋白質(zhì)、核酸相比擬的信息功能，與蛋白質(zhì)、核酸一樣，糖類也是涉及生命活動本質(zhì)的三類生物大分子之一[2-3]。早期人們普遍認(rèn)為多糖類物質(zhì)本身沒有活性，但隨著研究的深入，多糖類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性逐漸被研究人員揭示，許多動植物多糖類物質(zhì)均展現(xiàn)出了很強(qiáng)的生物活性，如：降血脂、降血糖、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗氧化和抑菌等作用[4-8]，部分已被醫(yī)學(xué)界在臨床上用于腫瘤、肝炎和心血管疾病等的輔助和康復(fù)治療，因此，對植物多糖的研究已成為當(dāng)今國內(nèi)外研究熱點之一[9]。本文基于前期的研究工作，考察了啤酒花多糖的提取和脫蛋白工藝，旨在為啤酒花中多糖類物質(zhì)的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒花（品種為馬可波羅） 新疆三寶樂農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司，采用超臨界液態(tài)二氧化碳萃取后的啤酒花殘渣，實驗前采用95%的乙醇進(jìn)一步脫除其中小分子量的單糖和部分雜質(zhì)，低溫干燥后備用；木瓜蛋白酶（活力單位＞800U/mg）、菠蘿蛋白酶（活力單位＞500u/mg） 上海源葉生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、苯酚（重蒸）、濃硫酸、葡萄糖、95%乙醇、濃磷酸、氯仿、正丁醇、三氯乙酸等試劑 均為分析純。

R-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申科機(jī)械研究所；BS210S電子天平 德國賽多利斯，讀數(shù)精度：0.1mg，稱重范圍：0～210g；UV-5300紫外/可見分光光度計上海元析儀器有限公司；PHS-3DpH計 上海精密儀器有限公司雷磁儀器廠；79-1磁力加熱攪拌器 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；LD4-2離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；WP750L23-6微波爐 格蘭仕。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗多糖的提取及含量測定 啤酒花粗多糖的提?。悍Q取適量上述處理的啤酒花樣品置于燒杯中，按一定料液比、提取溫度和提取時間在熱水浴中浸提3次，冷卻后過濾，合并清液，清液經(jīng)減壓濃縮至一定體積后，加入95%乙醇，使多糖溶液中乙醇濃度為80%，醇沉24h取底部析出的粗多糖配成一定體積的溶液。采用苯酚-硫酸法[10]測定其吸光度，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品，橫坐標(biāo)為葡萄糖濃度，縱坐標(biāo)為吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其含量。其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.02271+9.29524C，相關(guān)系數(shù)R=0.9995，線性范圍0.01～0.09mg/mL。據(jù)此計算出樣品中啤酒花多糖的含量（式1）并根據(jù)測定結(jié)果計算多糖提取率。

式中：C為樣品溶液多糖濃度（mg/mL）；V為樣品溶液體積（mL）；D為樣品溶液稀釋倍數(shù)；W：樣品質(zhì)量（mg）。

1.2.2 粗多糖中蛋白質(zhì)含量的測定 蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[11]。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品，橫坐標(biāo)為牛血清白蛋白濃度，縱坐標(biāo)為吸光值，繪制蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。根據(jù)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=0.05697+0.75183C，相關(guān)系數(shù)R=0.99889，線性范圍0.1～0.9mg/mL。據(jù)此計算出樣品中蛋白的濃度，再根據(jù)式（2）計算蛋白的含量。

式中：C為樣品溶液蛋白濃度（mg/mL）；V為樣品溶液體積（mL）；D為樣品溶液稀釋倍數(shù)；W：樣品質(zhì)量（mg）。

1.2.3 粗多糖脫蛋白方法

1.2.3.1 Sevag法[12]取2g/100mL粗多糖溶液50mL，加入其1/4體積的Sevag試劑（V氯仿∶V正丁醇=4∶1），磁力攪拌20min，3000r/min離心5min棄去沉淀，取上層清液再加入Sevag試劑按上述方法重復(fù)操作，分別取每次離心后的上清液測定其蛋白含量和多糖含量，確定Sevag法最佳的脫蛋白次數(shù)。

1.2.3.2 木瓜（papain）/菠蘿蛋白酶（bromelain）法[13]木瓜蛋白酶或菠蘿蛋白酶取0.05g，用蒸餾水溶解，精確定容50mL，得到酶液最終濃度為1mg/mL，pH為7.0。將粗多糖溶液（2g/100mL）放入37℃水浴鍋中預(yù)熱10min，在一定溫度和一定pH下加入蛋白酶，酶解一定時間后，離心，取上清液測定溶液中蛋白含量和多糖含量。選取酶添加量、酶解時間、溫度、pH四個因素，各取三個水平，進(jìn)行L9（34）正交實驗，以獲得最佳酶法脫蛋白條件。

1.2.3.3 鹽酸（HCl）/鹽酸-正丁醇法（HCl-n-butanol）

取5份20mL粗多糖溶液（2g/100mL），分別加入2mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，4℃靜置過夜。次日3000r/min離心20min，棄去沉淀收集上清液，測定上清液中蛋白質(zhì)含量和多糖含量[14]。確定最佳條件后，向其加入正丁醇（V多糖溶液∶V正丁醇=5∶1），磁力攪拌20min，3000r/min離心5min，棄去上層蛋白質(zhì)，取下層清液再加入正丁醇重復(fù)操作，分別取每次離心后的清液測定其蛋白含量和多糖含量，通過分析脫蛋白次數(shù)對多糖溶液中多糖含量和蛋白含量的影響，確定最佳的脫蛋白條件。

1.2.3.4 三氯乙酸（TCA）/三氯乙酸-正丁醇法（TCA-n-butanol） 取5份20mL粗多糖溶液（2g/100mL），分別加入5%的TCA溶液調(diào)節(jié)pH至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，4℃靜置過夜。次日3000r/min離心20min，棄去沉淀收集上清液，測定上清液中蛋白質(zhì)含量和多糖含量[15]。確定最佳條件后，按1.2.3.3鹽酸-正丁醇法中正丁醇的處理方法進(jìn)行后續(xù)脫蛋白操作，確定最佳的脫蛋白條件。

1.2.3.5 木瓜/菠蘿蛋白酶-Sevag法（papain/bromelain-Sevag） 將粗多糖溶液（2g/100mL）放入37℃水浴鍋中預(yù)熱10min，按1.2.3.2得到的木瓜/菠蘿蛋白酶脫蛋白最優(yōu)條件對樣品脫蛋白實驗，再按1.2.3.1 Sevag法最佳的脫蛋白條件處理后，即得木瓜/菠蘿蛋白酶-Sevag法的脫蛋白溶液，測定其蛋白含量和多糖含量，確定此法的蛋白脫除率和多糖保留率。

1.2.3.6 木瓜/菠蘿蛋白酶-鹽酸-正丁醇法（papain/bromelain-HCl-n-butanol） 將粗多糖溶液（2g/100mL）放入37℃水浴鍋中預(yù)熱10min，按1.2.3.2得到的木瓜/菠蘿蛋白酶脫蛋白最優(yōu)條件進(jìn)行脫蛋白實驗，再按1.2.3.3鹽酸-正丁醇法所述實驗條件脫蛋白一次后，即得木瓜/菠蘿蛋白酶-鹽酸-正丁醇法的脫蛋白溶液，測定其蛋白含量和多糖含量，確定此法的蛋白脫除率和多糖保留率。

1.2.3.7 木瓜/菠蘿蛋白酶-三氯乙酸-正丁醇法（papain/bromelain-TCA-n-butanol） 將粗多糖溶液（2g/100mL）放入37℃水浴鍋中預(yù)熱10min，按1.2.3.2得到的木瓜/菠蘿蛋白酶脫蛋白最優(yōu)條件進(jìn)行脫蛋白實驗，再按1.2.3.4三氯乙酸-正丁醇法所述實驗條件脫蛋白一次后，即得木瓜/菠蘿蛋白酶-三氯乙酸-正丁醇法的脫蛋白溶液，測定其蛋白含量和多糖含量，確定此法的蛋白脫除率和多糖保留率。

1.2.4 啤酒花多糖保留率及蛋白脫除率的計算

1.3 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析結(jié)果均是采用Microsoft Excel或Origin Pro 8.0專業(yè)軟件來處理的，實驗數(shù)據(jù)表示為平均值（n≥3）±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 啤酒花多糖提取正交實驗

啤酒花粗多糖的提取是采用水提醇沉的方法完成的。本實驗以提取溫度、料液比、提取時間為考察因素，以粗多糖提取率為考核指標(biāo)，選擇L9（34）正交表設(shè)計了三因素三水平的正交實驗，誤差用空列來估計，結(jié)果見表1。

表1 正交實驗結(jié)果Table 1 Results of three-factors，three-levels orthogonal array design experiments

對正交實驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

表2 方差分析表Table 2 Analysis of variance

由表1和表2可知，三個因素對啤酒花多糖提取率的影響均不顯著，其中，誤差項的極差大于提取時間的影響，可能是由于正交實驗選擇的時間因素范圍較窄，未能反應(yīng)出提取時間的影響，因此，時間的影響尚需通過進(jìn)一步的單因素實驗來考察。由正交實驗經(jīng)極差分析得到的最優(yōu)組合為A3B2C3，即溫度為90℃、料液比為1∶10、提取時間5h。此條件下多糖提取率為2.47%。

2.2 微波處理對多糖提取工藝的優(yōu)化

由正交實驗極差分析可知提取時間5h為最好的因素，但該實驗組合并未出現(xiàn)在正交實驗中，且正交實驗所反映出的提取時間的選擇也不完全恰當(dāng)，因此，單因素實驗中首先對提取時間對多糖提取率的影響進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化。同時，由于正交實驗中并未對微波作用時間進(jìn)行優(yōu)化，單因素實驗也對此條件進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2.1 提取時間對粗多糖提取率的影響 本實驗在正交實驗確定了溫度90℃、料液比1∶10、微波功率750W的條件下，采用單因素實驗考察了微波輔助提取3min在1、2、3、4、5h提取時間下啤酒花多糖提取率依次為1.79%、2.37%、2.42%、2.43%和2.47%。結(jié)果表明，在1h和2h的提取條件下，多糖提取率增長比較明顯，2h以后多糖提取率基本趨于平衡，這可能是由于隨著時間的延長，多糖會水解，所以提取的時間不宜過長，同時為了減少能源的損耗，采用2h作為最佳提取時間。

2.2.2 微波作用時間對粗多糖提取率的影響 根據(jù)2.2.1的結(jié)果，3min微波輔助作用即可有效地提高萃取效率?？紤]到當(dāng)微波作用時間較短時，啤酒花多糖分子可能會釋放不充分，因此，下列實驗對在提取溫度90℃、料液比1∶10、提取時間為2h、微波功率750W的條件下，采用單因素實驗考察了微波作用時間在3、6、9、12、15min下啤酒花多糖提取率依次為2.37%、2.52%、2.65%、2.76%和2.79%。結(jié)果表明，隨著微波作用時間的增長，多糖提取率依次升高，但是12min和15min多糖提取率趨于穩(wěn)定，為了減少能耗，同時避免由于微波作用可能會造成多糖的損失，最終選擇微波作用時間為12min。

比較上述正交實驗和單因素實驗結(jié)果可知，優(yōu)化后的啤酒花多糖的最佳提取工藝條件為提取溫度90℃、料液比1∶10、提取時間2h、期間采用微波輔助萃取12min。由于蛋白質(zhì)的溶解性與多糖相似，采用水提醇沉法所得到的粗多糖中蛋白質(zhì)的含量也較高，由上述工藝所得啤酒花多糖粗提物中經(jīng)測定多糖含量為15.85%，蛋白質(zhì)含量為22.75%。因此，為了提高多糖的含量以便進(jìn)一步純化樣品，又對啤酒花多糖粗提物中蛋白質(zhì)的脫除工藝進(jìn)行了研究。

2.3 啤酒花粗多糖脫蛋白工藝的研究

脫蛋白是對多糖進(jìn)行純化的第一步，多糖中的蛋白質(zhì)主要以兩種形式存在，一是以純糖鏈，另一種是糖鏈與肽鏈結(jié)合，形成的糖肽或糖蛋白。多糖脫蛋白并不是為了徹底去除蛋白，主要是脫除游離蛋白。本實驗以蛋白脫除率和多糖保留率來考察啤酒花粗多糖中蛋白質(zhì)的脫除效果，比較了Sevage法、木瓜/菠蘿蛋白酶法、鹽酸-正丁醇法、三氯乙酸（TCA）-正丁醇法以及酶法分別和上述幾種方法結(jié)合對脫除啤酒花粗多糖中蛋白質(zhì)的工藝條件，通過方法組合和工藝優(yōu)化確定最優(yōu)方案。

2.3.1 Sevag法 圖1為Sevag法進(jìn)行脫蛋白的實驗結(jié)果。結(jié)果表明，隨著Sevag法重復(fù)操作次數(shù)的增加，蛋白脫除率逐漸升高，但總體上脫除對蛋白質(zhì)的脫除效率不高，且重復(fù)4次后蛋白脫除率基本不再變化，而多糖保留率會隨對蛋白脫除次數(shù)的增加逐漸下降。這可能是由于Sevag試劑反復(fù)處理后形成的凝膠物中會夾帶少量多糖物質(zhì)，并且少量與多糖結(jié)合很牢或被多糖包裹的糖蛋白也難以用Sevag法徹底脫除，同時，與蛋白結(jié)合的糖蛋白也容易發(fā)生凝聚沉淀，將會導(dǎo)致樣品中多糖保留率的下降。此外，實驗過程中使用的有機(jī)溶劑氯仿和正丁醇不但容易造成多糖活性下降，而且還會造成有毒溶劑氯仿的殘留。當(dāng)Sevag法處理6次后，蛋白脫除率僅為23.73%、多糖保留率也下降到76.76%，即多糖中大部分蛋白仍未能去除。因此，啤酒花粗多糖脫蛋白不宜采用Sevag法。

2.3.2 木瓜/菠蘿蛋白酶法 酶法脫蛋白在多糖純化過程中應(yīng)用較多，其操作過程簡單，一次即可完成，并能減少多糖的損失；操作條件溫和，有利于保持多糖的活性；酶解過程中蛋白酶可將蛋白質(zhì)分解成小分子，可降低溶液濃度，有利于多糖溶出，且避免了有毒的有機(jī)溶劑帶來的危害[16]。因此采用木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶進(jìn)行正交實驗考察脫蛋白工藝條件，從而選擇出最優(yōu)條件。由于酶活性對pH和溫度比較敏感，酶解時間和酶濃度會影響蛋白脫除率，因此以酶解溫度、酶解時間、酶添加量、pH為考察因素，采用加權(quán)評分法對其正交實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用了L9（34）正交實驗設(shè)計，進(jìn)行了四因素三水平實驗。本實驗結(jié)果分析采用綜合加權(quán)評分法，評分公式為：綜合指數(shù)（%）=脫蛋白率（%）×2+多糖保留率（%）。表3為木瓜蛋白酶的正交實驗的因素水平和正交實驗結(jié)果；表4為菠蘿蛋白酶的正交實驗的因素水平和正交實驗結(jié)果。

圖1 Sevag法對蛋白脫除率及多糖保留率的影響Fig.1 Effect of Sevag method on the protein removal rate and polysaccharide retention rate

表3 木瓜蛋白酶正交實驗結(jié)果Table 3 Results of four-factors，three-levels orthogonal array design experiments

表4 菠蘿蛋白酶正交實驗結(jié)果Table 4 Results of four-factors，three-levels orthogonal array design experiments

由表3極差分析結(jié)果可以看出，影響木瓜蛋白酶法蛋白脫除率的因素依次為：pH＞酶解時間＞酶解溫度＞酶添加量。最優(yōu)水平組合為A2B1C3D1，即酶解溫度為55℃、酶解時間為0.5h、酶添加量為36U/mL、pH為5.5。此條件下，蛋白脫除率為22.71%，多糖保留率為92.34%，綜合指數(shù)為137.76%。

由表4極差分析結(jié)果可以看出，影響菠蘿蛋白酶法蛋白脫除率的因素依次為：pH＞酶解時間＞酶添加量＞溫度。最優(yōu)水平組合為A2B1C3D1，即溫度為45℃、酶解時間為0.5h、酶添加量為22.5U/mL、pH為5.5。此條件下，蛋白脫除率為26.73%，多糖保留率為89.41%，綜合指數(shù)為142.87%。

由以上結(jié)果可以看出，酶法對多糖中蛋白的脫除率較低，可能是由于這兩種蛋白酶對啤酒花中蛋白質(zhì)的專屬性較差，因此，單一使用酶法很難將多糖粗提取物中的蛋白質(zhì)除去。

2.3.3 鹽酸-正丁醇法 圖2為單獨采用鹽酸進(jìn)行脫蛋白的實驗結(jié)果。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)液pH的增大，溶液中蛋白脫除率逐漸下降，但在pH＞3后變化不明顯，多糖保留率則呈逐漸上升的趨勢，其保留率都在90%之上，在pH為4時，多糖的保留率甚至達(dá)到了96.58%。當(dāng)反應(yīng)液pH為2時，蛋白脫除率最高可達(dá)47.42%，此時多糖保留率也可達(dá)90.51%，故確定pH=2時為鹽酸脫蛋白的最優(yōu)條件。圖3為鹽酸-正丁醇法進(jìn)行脫蛋白的實驗結(jié)果。結(jié)果表明，此法脫蛋白效果要比單獨采用鹽酸進(jìn)行脫蛋白和Sevag法脫蛋白效果明顯。反應(yīng)液中蛋白脫除率隨著正丁醇脫蛋白次數(shù)的增加而不斷增大，在處理3次后蛋白脫除率趨于平穩(wěn)，而多糖保留率卻隨著脫蛋白次數(shù)的增加而不斷減小，多糖保留率較低。這可能是由于實驗中正丁醇試劑的反復(fù)使用中夾帶少量多糖物質(zhì)，造成凝聚，導(dǎo)致多糖保留率降低。故確定鹽酸-正丁醇法最佳的脫蛋白條件為pH=2，正丁醇處理3次，其蛋白脫除率為77.13%、多糖保留率為73.56%。

圖2 鹽酸法對蛋白脫除率及多糖保留率的影響Fig.2 Effect of hydrochloric acid method on the protein removal rate and polysaccharide retention rate

圖3 鹽酸-正丁醇法對蛋白脫除率及多糖保留率的影響Fig.3 Effect of hydrochloric acid-n-butanol method on the protein removal rate and polysaccharide retention rate

2.3.4 三氯乙酸-正丁醇法 圖4為單獨采用三氯乙酸進(jìn)行脫蛋白的實驗結(jié)果。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)液酸度的增大，溶液中蛋白脫除率逐漸上升，而多糖保留率則呈逐漸下降趨勢。這可能是由于隨著酸度的增大，即三氯乙酸用量的加大，其與蛋白質(zhì)結(jié)合生成的沉淀會吸附一部分的多糖，造成多糖保留率明顯下降。當(dāng)反應(yīng)液pH=2時，蛋白脫除率達(dá)到最高值為55.56%，此時多糖保留率為82.89%，效果較好，故確定pH=2是三氯乙酸脫蛋白的最佳條件。圖5為三氯乙酸-正丁醇法進(jìn)行脫蛋白的實驗結(jié)果。結(jié)果表明，此法與鹽酸-正丁醇法的脫蛋白率和多糖保留率相比，其變化趨勢相一致，且其脫蛋白率與鹽酸-正丁醇法的結(jié)果基本相同，但其多糖保留率較低，在使用正丁醇處理3次后，其多糖保留率僅有62.91%。故確定三氯乙酸-正丁醇法最佳的脫蛋白條件為pH=2，正丁醇處理3次，其蛋白脫除率為77.88%、多糖保留率為62.91%。

圖4 三氯乙酸法對蛋白脫除率及多糖保留率的影響Fig.4 Effect of trichloroacetic acid method on the protein removal rate and polysaccharide retention rate

圖5 三氯乙酸-正丁醇法對蛋白脫除率及多糖保留率的影響Fig.5 Effect of trichloroacetic acid-n-butanol method on theprotein removal rate and polysaccharide retention rate

2.3.5 酶法聯(lián)用進(jìn)行脫蛋白結(jié)果比較 采用Sevag法進(jìn)行脫蛋白，其效率較低，且需重復(fù)多次，增加了多糖隨凝膠物沉淀而損失的可能。采用鹽酸-正丁醇法和三氯乙酸-正丁醇法進(jìn)行脫蛋白，其蛋白脫除率較Sevag法有很大地提高，但多糖損失較大，且正丁醇的反復(fù)使用有可能導(dǎo)致部分多糖的降解?？紤]到酶法條件溫和，可以使大部分的游離蛋白質(zhì)和部分結(jié)合蛋白水解，應(yīng)該可以減少溶劑的處理次數(shù)，因此下列實驗比較了上述方法與酶法聯(lián)用對多糖中蛋白質(zhì)的脫除效果，結(jié)果見表5。

表5 各種脫蛋白方法的結(jié)果比較（%）Table 5 Comparisons of protein removal rates and polysaccharide retention rate by different deproteinization methods（%）

由表5可知，酶法與化學(xué)法聯(lián)用脫除啤酒花多糖中蛋白質(zhì)的效果明顯優(yōu)于單獨采用酶法或化學(xué)法脫蛋白效果，同時由于溶劑處理次數(shù)減少，多糖保留率也均有提高。其中，酶法與Sevag法聯(lián)用的蛋白脫除率提高的效果最為明顯，可能是由于一些與多糖結(jié)合很牢或被多糖包裹的蛋白無法被Sevag法單獨除去，采用酶法聯(lián)用可以將少許蛋白降解下來，同時減少了溶劑的使用次數(shù)。但總體分析，酶-鹽酸/三氯乙酸-正丁醇法的蛋白脫除率和多糖保留率明顯高于酶-Sevag法。其中，菠蘿蛋白酶-三氯乙酸-正丁醇的脫蛋白效果最為理想，經(jīng)過1次處理后，蛋白脫除率和多糖保留率分別為86.77%和77.37%，基本能將粗多糖中的蛋白除去，同時并沒有造成多糖過度的損失。而木瓜蛋白酶-鹽酸-正丁醇法脫蛋白的效果略低，但多糖的保留率得到了有效地提高，也不失為一種較好的工藝條件。

3 結(jié)論

近年來的研究表明，許多植物中的多糖類物質(zhì)均具有一定的生理活性，但往往由于資源缺乏或含量較低，對其有效利用并非易事。啤酒花為新疆的特色經(jīng)濟(jì)作物，在其加工過程中有約80%以上的萃余物被廢棄，如能提取并分離其中的多糖類物質(zhì)，從中篩選活性較高的啤酒花多糖組分，對擴(kuò)大植物活性多糖的來源和拓展啤酒花的使用范圍，增加綜合利用的價值均具有一定的意義。本文通過正交實驗和單因素實驗的比較，得到了啤酒花多糖的最佳提取方法為采用熱水微波輔助萃取工藝：提取時間2h、提取溫度90℃、料液比1∶10、微波作用時間12min；在此條件下啤酒花多糖的提取率為2.76%。對提取得到的粗多糖，可采用酶-鹽酸/三氯乙酸-正丁醇法的方法進(jìn)行脫蛋白處理，經(jīng)此處理后，可得到多糖含量約為60%左右，而蛋白質(zhì)含量低于1%的啤酒花多糖提取物。該方法溶劑使用量小，操作簡單，可得到初步提純后的啤酒花多糖樣品，為進(jìn)一步的純化和結(jié)構(gòu)分析、鑒定奠定了研究基礎(chǔ)。

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Extraction and protein removal of polysaccharides from hops

QIAO Qian-qian，QI Ying，SUN Jian-zhong，LIU Yu-mei*
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Xinjiang University，Urumqi 830046，China）

TS261

B

1002-0306（2012）16-0251-06

2012－02－01 *通訊聯(lián)系人

喬茜茜（1986-），女，在讀碩士，主要從事天然產(chǎn)物功能因子與分析檢測的研究。

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆計劃項目（200991247）。