烏日娜，岳喜慶，張和平

1(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)，110866)

2(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部乳品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特，010018)

益生菌Lactobacillus casei Zhang在酸脅迫下的蛋白質(zhì)組學(xué)研究*

烏日娜1，岳喜慶1，張和平2

1(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)，110866)

2(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部乳品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特，010018)

Lactobacillus casei Zhang是1株篩選自發(fā)酵酸馬奶，并具有耐酸等益生特性的益生乳桿菌。該研究利用蛋白質(zhì)組雙向電泳，比較了其在pH值為7.0和5.5的培養(yǎng)液中分別生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異。結(jié)果表明，有11個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)發(fā)生明顯變化，經(jīng)過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定，其中有3個(gè)表達(dá)增強(qiáng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)分別鑒定為翻譯因子(EF-Tu)，N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脫醛酶(NagA)和小熱休克蛋白(sHsp)。酸脅迫可誘導(dǎo)乳酸菌產(chǎn)生復(fù)雜的酸應(yīng)激反應(yīng)，涉及不同的代謝調(diào)控途徑。

Lactobacillus casei Zhang，蛋白質(zhì)組，酸脅迫

酸馬奶是由乳酸菌和酵母菌發(fā)酵而成的酒精性飲料，在中國(guó)的內(nèi)蒙古、蒙古和俄羅斯等地十分流行。研究顯示，干酪乳桿菌屬是采集于內(nèi)蒙古地區(qū)的酸馬奶樣品中的優(yōu)勢(shì)乳桿菌發(fā)酵劑[1］。張和平教授等從中篩選出1株益生菌Lactobacillus casei Zhang。該菌株具有較強(qiáng)的耐酸和耐膽鹽特性，且可對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫功能產(chǎn)生多方面的、有利于機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用[2-3］。

耐酸特性是篩選益生菌的一個(gè)基本條件，因?yàn)楫?dāng)益生菌以制劑或與食品口服，需要經(jīng)過(guò)胃部的酸性環(huán)境脅迫，并且達(dá)到一定的活菌數(shù)，才有可能進(jìn)入腸道進(jìn)而定植。為了探索益生菌對(duì)酸脅迫產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)理，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是十分有效的方法之一。蛋白質(zhì)組(proteome)是指由1個(gè)基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)[4］。雙向凝膠電泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)，由O＇Farrell等提出[5］。利用雙向電泳技術(shù)構(gòu)建蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，可以分離得到數(shù)以百計(jì)的蛋白質(zhì)。然而，有關(guān)乳酸菌蛋白質(zhì)組學(xué)的研究開(kāi)展較晚。目前國(guó)外已報(bào)道了Lactococcus lactic[6］和雙歧桿菌Bifidobacterium longum[7］，及部分乳桿菌 Lactobacillus sanfranciscensis[8］，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus[9］，Lactobacillus reuteri[10］等在酸脅迫下的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。結(jié)果表明，酸脅迫條件可誘導(dǎo)乳酸菌蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生變化。但是，上述研究多以酸適應(yīng)性反應(yīng)(acid tolerance response，ATR)為酸脅迫的條件，而對(duì)乳酸菌在酸環(huán)境下生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究較少。

本項(xiàng)研究以益生菌L.casei Zhang為研究對(duì)象，利用雙向電泳技術(shù)構(gòu)建了該菌株在pH值分別為7.0和5.5的培養(yǎng)條件下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，并且進(jìn)行了差異比較分析，為揭示其中可能與L.casei Zhang耐酸特性的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:干酪乳桿菌L.casei Zhang，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

改良MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏粉 10 g，葡萄糖 20 g，吐溫-801g，K2HPO42 g，乙酸鈉5g，檸檬酸三銨2g，MgSO4·7H2O 0.2 g，Mn-SO4·4H2O 0.05 g。

試劑:MES、MOPS，北京天為時(shí)代公司;丙烯酸胺、Tris、SDS、TEMED、N，N＇-甲叉雙丙烯酞胺、硝酸銀、三氯乙酸，美國(guó) Sigma公司;尿素、硫脲、DTT、CHAPS、碘乙酰胺、考馬斯亮藍(lán)、IPG(Immobilized pH gradient)干膠條(18 cm、pI 4～7)，美國(guó)Bio-rad公司;正丁醇、過(guò)硫酸胺、無(wú)水乙酸鈉、丙酮、EDTA、Na2S2O3、Na2CO3等。

1.2 儀器與設(shè)備

等電聚焦儀、Ettan DALT Twelve system裝置、Image Scanner掃描儀及Image Master 5.0圖像分析系統(tǒng)，美國(guó)GE公司;TGL-168低溫離心機(jī)，德國(guó)Eppen-dorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 干酪乳桿菌的培養(yǎng)

將活化3代的L.casei Zhang供試菌液以1%的量(OD600nm約為0.06)分別接種于新鮮的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有100 mmol/L的MES和MOPS緩沖劑，pH值分別為 pH7.0和 pH5.5(用 KOH調(diào)節(jié))[11］。以每管5 mL的量分裝試管，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每隔1 h取樣，繪制L.casei Zhang在不同pH值條件培養(yǎng)下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.2 蛋白質(zhì)樣品的提取與制備

離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的菌體，利用研缽將收集的菌體進(jìn)行液氮研磨破碎，然后采用TCA/丙酮沉淀法制備蛋白質(zhì)樣品[5，12］。利用 Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.3.3 雙向凝膠電泳[13］

將菌體蛋白樣品100 μg加入溶脹液中，使總體積為350 μL。充分混勻后，將其加入到持膠槽中，并將IPG干膠條，膠面向下放于樣品之上進(jìn)行溶脹。膠條溶漲后，進(jìn)行第一向等電聚焦。等電聚焦參數(shù)為:無(wú)電壓6 h，50 V 恒電壓電泳6h;250、500、4000 V和8000 V線(xiàn)性梯度電壓電泳1 h，再以8000 V電壓電泳65000 V·h。聚焦結(jié)束后，將膠條分別放入含有1%濃度DTT的SDS平衡液和含有2.5%濃度的碘乙酞胺SDS平衡緩沖液中，于搖床上平衡15 min。然后，將膠條轉(zhuǎn)移至12%的SDS聚丙烯酞胺凝膠(26 cm×20 cm)，進(jìn)行電泳，約5～6 h后，停止電泳，取下凝膠采用銀染法進(jìn)行染色。

1.3.4 圖像分析及質(zhì)譜鑒定

利用Image 5.0圖像分析軟件對(duì)凝膠圖像進(jìn)行分析。選取同一條件下的2塊平行膠構(gòu)建一個(gè)參考膠，然后通過(guò)參考膠蛋白質(zhì)量(volume)的匹配和比較進(jìn)行不同條件下蛋白質(zhì)表達(dá)的分析，對(duì)能匹配上的點(diǎn)進(jìn)行位置和量重復(fù)性分析，對(duì)不能匹配上的點(diǎn)進(jìn)行差異表達(dá)量分析。

從膠上選取差異蛋白點(diǎn)，切下后，經(jīng)胰酶消化，并利用MALDI-TOF/MS質(zhì)譜對(duì)肽段樣品進(jìn)行鑒定。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值，加速電壓19 kV，m/z范圍為600～4000，誤差范圍為10 ppm。通過(guò)軟件MASCOT software 1.9(Matrix Science)，以NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)中革蘭氏陽(yáng)性菌已知數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，進(jìn)行蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值條件下生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制

L.casei Zhang在pH7.0和pH5.5的MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖1所示。在低pH條件下，細(xì)菌總數(shù)明顯降低，說(shuō)明該菌株的生長(zhǎng)受到抑制。此外，緩沖劑的加入，使L.casei Zhang在進(jìn)入穩(wěn)定期前可維持初始pH在±0.1～±0.3的范圍內(nèi)緩慢降低，可基本維持pH7.0和pH5.5，在進(jìn)入穩(wěn)定期后，培養(yǎng)液的pH值才會(huì)顯著下降。

圖1 干酪乳桿菌在不同pH值條件下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.2 雙向電泳圖像分析

圖2 L.casei Zhang在不同pH下生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的蛋白質(zhì)組雙向電泳表達(dá)圖譜

利用雙向電泳技術(shù)，試驗(yàn)中構(gòu)建了 L.casei Zhang在不同pH值下生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)組2-DE圖譜(圖1)。通過(guò)Image 5.0圖像分析，結(jié)果表明，2塊平行膠的匹配率均在90%以上，可檢測(cè)到的斑點(diǎn)分別為493 ±6(pH 7.0)和496±8(pH 5.5)。

2.3 雙向電泳差異表達(dá)譜比較

經(jīng)Image 5.0圖像分析軟件比較分析顯示，L.casei Zhang在pH7.0和pH5.5生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的2-DE表達(dá)譜中，有11個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)發(fā)生明顯變化(2.5倍以上)，如表1所示。

表1 L.casei Zhang在pH7.0和pH5.5培養(yǎng)基MRS中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的差異表達(dá)蛋白質(zhì)

由表1可知，在11個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)中，3個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)可通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)鑒定為對(duì)應(yīng)的蛋白，有8個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)未鑒定出匹配結(jié)果。其中，有6種蛋白質(zhì)在穩(wěn)定期表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)2.5倍以上，包括翻譯因子(EF-Tu，spot Z1)，N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脫醛酶(NagA，spot Z4)，小熱休克蛋白(sHsp，spot Z10)，及未鑒定出的蛋白質(zhì)點(diǎn)(spot Z2，spot Z5和 spot Z8);而有3個(gè)蛋白質(zhì)(spot Z6，spot Z7，spot Z9)的表達(dá)量在穩(wěn)定期下降;有2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)分別只在pH 7.0(Unidentified，spot Z11)或者pH 5.5對(duì)生長(zhǎng)期表達(dá)(Unidentified，spot Z3)。

3 討論

酸脅迫可誘導(dǎo)乳酸菌產(chǎn)生復(fù)雜的酸應(yīng)激反應(yīng)，涉及不同的代謝調(diào)控途徑。L.casei Zhang在pH5.5的MRS生長(zhǎng)，與在pH7.0的MRS生長(zhǎng)的2-DE圖譜差異比較分析，由酸誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的3種蛋白質(zhì)，就屬于應(yīng)激蛋白、糖代謝和翻譯代謝調(diào)控3種不同的路徑。此外，在L.casei Zhang對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與穩(wěn)定期生長(zhǎng)的2-DE比較研究中，這3種蛋白質(zhì)的表達(dá)量在穩(wěn)定期時(shí)也強(qiáng)于對(duì)數(shù)期。

3.1 應(yīng)激蛋白質(zhì)

L.casei Zhang中小熱休克蛋白(sHsp，spot Z10)在pH 5.5時(shí)表達(dá)增強(qiáng)。熱休克蛋白質(zhì)是被較早發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)應(yīng)激蛋白質(zhì)，具有修復(fù)或解折疊損傷蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能[14］。熱休克蛋白 GroEL(Hsp 60)和DnaK(Hsp 70)是較為常見(jiàn)的應(yīng)激反應(yīng)蛋白質(zhì)，多個(gè)蛋白質(zhì)組研究都報(bào)道了不同乳酸菌在酸應(yīng)激反應(yīng)下被誘導(dǎo)，并且，不同的環(huán)境脅迫也可誘導(dǎo)GroEL和DnaK產(chǎn)生表達(dá)量的變化[15］。目前，有關(guān)乳酸菌小熱休克蛋白的研究相對(duì)較少。

3.2 糖代謝及細(xì)胞膜保護(hù)作用

NagA可催化氨基糖類(lèi)的代謝，及催化N-乙酰-D-6-磷酸葡萄糖胺與D-6-磷酸果糖的轉(zhuǎn)化，而N-乙酰-D-6-磷酸葡萄糖胺是N-乙酰-D-葡萄糖胺和UDP-N-乙酰胞壁酸的前體，所以，NagA與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖和磷壁酸的合成有關(guān)[16］。細(xì)胞壁是細(xì)菌抵抗外界環(huán)境的第一道屏障。NagA的表達(dá)量在低酸是表達(dá)量增強(qiáng)，有利于維持細(xì)胞形態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞壁的保護(hù)作用。

3.4 翻譯因子

L.casei Zhang的延伸因子EF-Tu在pH5.5時(shí)有明顯增強(qiáng)，它的主要功能不僅是傳送aminoacyl-tRNA到核糖體，同時(shí)對(duì)Escherichia coli的研究表明，EF-Tu與蛋白質(zhì)的折疊或應(yīng)激保護(hù)有關(guān)[17-18］。L.reuteri和P.freudenreichii[10，19］的蛋白質(zhì)組研究報(bào)道，酸脅迫可誘導(dǎo)相應(yīng)的EF-Tu蛋白發(fā)生表達(dá)量發(fā)生變化。因此可能說(shuō)明，L.casei Zhang的EF-Tu的變化與其酸應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

未鑒定出結(jié)果的差異表達(dá)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)可能在L.casei Zhang的耐酸生長(zhǎng)過(guò)程中起到重要作用，因此，下一步筆者將繼續(xù)完成蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定及驗(yàn)證工作。

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ABSTRACTLactobacillus casei Zhang，isolated from traditional home-made koumiss in Inner Mongolia of China，has been considered as a new probiotic bacterium for its characteristics，especially acid tolerance.Proteomics researches were carried out to identify proteins expression of Lactobacillus casei Zhang grown at different pH values of pH 7.0 and 5.5.Cytosolic proteins of mid-exponential phase were resolved and further analyzed by two-dimensional gel electrophoresis.As results shown，eleven protein spots were found showing statistically significant differences.Three of total protein spots were identified as EF-Tu，NagA and sHsp using matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry(MALDI-TOF/MS)，indicating the complex response of lactic acid bacteria to acid stress.

Key wordsLactobacillus casei Zhang，proteomics，acid stress

Proteomics Researches on Acid Response of Lactobacillus casei Zhang Grown at Different pH Values Using Two-Dimensional Gel Electrophoresis

Wu Ri-na1，Yue Xi-qing1，Zhang He-ping2
1(College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China)
2(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Bioengineering，Ministry of Education，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China)

博士研究生(張和平教授為通訊作者)。

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31025019;31000805);教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT0967);973計(jì)劃前期研究專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目(2010CB134502);教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT0967);“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA100902);遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(LJQ2011071);沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)“天柱山英才計(jì)劃”

2012-02-03，改回日期:2012-06-11