杜林，李蓮

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州，510225)

2(中山大學(xué)生命科學(xué)院，廣東廣州，510275)

釀酒酵母中線(xiàn)粒體活性對(duì)甲酸處理下細(xì)胞死亡率的影響*

杜林1，李蓮2

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州，510225)

2(中山大學(xué)生命科學(xué)院，廣東廣州，510275)

已知甲酸可抑制線(xiàn)粒體呼吸鏈末端的細(xì)胞色素氧化酶，低濃度的甲酸可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體活性氧的快速爆發(fā)并進(jìn)一步殺死酵母細(xì)胞。因此，對(duì)可能影響釀酒酵母細(xì)胞線(xiàn)粒體產(chǎn)生活性氧的因素進(jìn)行了研究，分析了菌齡、低溫預(yù)處理、還原劑、線(xiàn)粒體ATP酶基因突變等對(duì)甲酸毒性的影響。結(jié)果表明，釀酒酵母對(duì)甲酸的抗性與線(xiàn)粒體活性密切相關(guān)，通過(guò)線(xiàn)粒體突變降低線(xiàn)粒體活性可增強(qiáng)釀酒酵母對(duì)甲酸的抗性。

釀酒酵母，甲酸抗性，線(xiàn)粒體，活性氧

甲酸是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的有機(jī)酸，也是一種弱有機(jī)酸。甲酸為酵母菌等微生物的代謝產(chǎn)物，但在濃度較高時(shí)其對(duì)酵母菌本身具有毒性。以纖維素為原料生產(chǎn)酒精是目前生物能源研究領(lǐng)域的一個(gè)重要內(nèi)容。纖維素可以用理化方法和生物方法進(jìn)行降解并以釀酒酵母發(fā)酵，但釀酒酵母在纖維素的水解液中的生長(zhǎng)情況往往并不理想[1-2］。甲酸由于生成的濃度較高，而最低抑菌濃度比乙酸等其他弱有機(jī)酸低十倍以上，是纖維素水解液中主要的抑菌因素之一。因此，酵母菌的甲酸抗性突變株在纖維素發(fā)酵產(chǎn)酒精中具有較大的價(jià)值。另外，在微生物制取氫氣方面，一個(gè)很有吸引力的方法是以釀酒酵母轉(zhuǎn)化各種生物原料產(chǎn)生甲酸，再以大腸桿菌等的氫化酶將甲酸分解為CO2和H2。但釀酒酵母難以耐受20 mmol/L以上的甲酸，因此獲得甲酸抗性突變株可以大大提高甲酸的積累濃度，并促進(jìn)這一技術(shù)的應(yīng)用[3］。但是，由于對(duì)甲酸細(xì)胞毒性機(jī)理的認(rèn)識(shí)不充分，目前并沒(méi)有見(jiàn)到構(gòu)建強(qiáng)甲酸抗性酵母菌株的報(bào)道。

甲醇在人體肝臟內(nèi)會(huì)被代謝為甲醛，并進(jìn)一步氧化為甲酸。因此在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域甲酸的毒性機(jī)理已得到較多研究[4］。已經(jīng)有研究者證明，甲酸和CO、氰化物、AS2O3等具強(qiáng)細(xì)胞毒性的化合物類(lèi)似，可以和線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的細(xì)胞色素氧化酶上亞鐵離子發(fā)生結(jié)合，抑制細(xì)胞色素氧化酶的活性[5-8］。我們據(jù)此推測(cè)，甲酸導(dǎo)致細(xì)胞快速死亡的機(jī)理不是由于細(xì)胞內(nèi)能量的耗盡，而是因?yàn)樗鸺?xì)胞色素氧化酶活性的異常，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生、爆發(fā)，進(jìn)而氧化破壞細(xì)胞。我們的初步研究表明，線(xiàn)粒體產(chǎn)生的活性氧和甲酸誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞死亡關(guān)系密切[9］。因此，我們推測(cè)，降低酵母菌線(xiàn)粒體活性，抑制活性氧的產(chǎn)生，可以增強(qiáng)釀酒酵母對(duì)甲酸的抗性。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

恒溫?fù)u床(哈爾濱東明儀器HZQ-C);培養(yǎng)箱(Thermo);流式細(xì)胞儀(Vantage SE，BD Biosciences)。

2.2 酵母菌菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)基

釀酒酵母BY4741由美國(guó)Rochester大學(xué)的David Goldfarb教授惠贈(zèng)。釀酒酵母W303-1a野生型菌株由中山大學(xué)微生物遺傳實(shí)驗(yàn)室提供，W303-1a背景ATP酶4亞基基因缺失株由中山大學(xué)微生物遺傳實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

YPD液體培養(yǎng)基:2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%D-(+)-葡萄糖，分裝后121℃高壓滅菌20 min。

2.3 酵母細(xì)胞的培養(yǎng)及甲酸處理后的酵母細(xì)胞存活率測(cè)定

取對(duì)數(shù)期釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液0.5 mL，接種至裝于250 mL三角瓶中的50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，置于30℃，200 r/min往復(fù)式振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)期或穩(wěn)定期，分別取1 mL菌液于1mL離心管中，立即加入相應(yīng)摩爾濃度的甲酸，30℃處理40 min后，在YPD培養(yǎng)基上以標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，每一稀釋度涂3個(gè)平板，以3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算存活率。

2.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧爆發(fā)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

細(xì)胞質(zhì)中活性氧檢測(cè):取5 mL YPD加入試管中，接入50 μL過(guò)夜培養(yǎng)的酵母菌液，搖床培養(yǎng)6h(30℃，200 r/min)。吸取以DMSO為溶劑的10 mmol/L雙乙酸二氯熒光黃(dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)溶液2 μmol/L，使染色時(shí)DCFH-DA的工作濃度為20 μmol/L，避光孵育15 min，使DCFH-DA充分進(jìn)入細(xì)胞。根據(jù)需要，迅速加入一定量的1mol/L甲酸，室溫或培養(yǎng)箱恒溫避光處理，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，分別吸取100 μL處理中的各樣品菌液加入FACS管中，加入900 μL冷藏的PBS，立即以流式細(xì)胞儀上樣分析。所用氬離子激光器激光波長(zhǎng)為488 nm，在530 nm檢測(cè)激發(fā)出的熒光，以流式細(xì)胞儀FL-1通道進(jìn)行檢測(cè)。或加入PI后以FL-1和FL-2通道檢測(cè)。

超氧陰離子的檢測(cè):先以無(wú)菌DMSO配置10 mmol/L的超氧化物陰離子熒光探針二氫溴化乙錠(Dihydroethidium，DHE)溶液，取0.5 μL加于1 mL菌液，使DHE的終濃度為5 μmmol/L，30℃避光孵育15 min，加入相應(yīng)濃度甲酸避光處理，以流式細(xì)胞儀FL-2通道進(jìn)行分析。激發(fā)光波長(zhǎng)為535 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為610 nm。

3 結(jié)果與分析

3.1 甲酸處理導(dǎo)致線(xiàn)粒體超氧陰離子的產(chǎn)生與自由基的擴(kuò)散

為了了解活性氧爆發(fā)時(shí)細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)過(guò)氧化氫等活性氧的水平，故使用活性氧熒光探針DCFH-DA和DHE同時(shí)對(duì)甲酸處理時(shí)細(xì)胞中的活性氧進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 FACS分析甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)活性氧和超氧陰離子產(chǎn)生

由圖1可見(jiàn)，在用甲酸處理10 min時(shí)，以熒光探針DCFH-DA和DHE依次檢測(cè)到活性氧的產(chǎn)生。細(xì)胞內(nèi)DHE陽(yáng)性率超過(guò)DCFH-DA的陽(yáng)性率，顯示DHE氧化后的熒光先產(chǎn)生。這和兩種熒光染料的特性有關(guān)，DHE可檢測(cè)線(xiàn)粒體產(chǎn)生的超氧陰離子，DCFH-DA可反映細(xì)胞質(zhì)中的活性氧水平。線(xiàn)粒體電子傳遞鏈障礙導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生時(shí)，超氧陰離子首先產(chǎn)生。所以實(shí)驗(yàn)中首先檢測(cè)到較多的細(xì)胞產(chǎn)生了超氧陰離子，而此時(shí)以DCFH-DA檢測(cè)到的細(xì)胞質(zhì)活性氧陽(yáng)性的細(xì)胞卻比超氧陰離子陽(yáng)性的細(xì)胞少，說(shuō)明細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的活性氧是由線(xiàn)粒體內(nèi)超氧陰離子擴(kuò)散形成。

3.2 還原劑預(yù)處理對(duì)活性氧爆發(fā)及存活率的影響

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)，是細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘肽的前體，因?yàn)槟軌蚩焖俅┻^(guò)細(xì)胞膜，因此是一種細(xì)胞生物學(xué)研究中廣泛使用的還原劑。NAC可在細(xì)胞內(nèi)形成含巰基的代謝產(chǎn)物，促進(jìn)GSH的合成，消除自由基。在用甲酸處理酵母細(xì)胞，使其細(xì)胞內(nèi)活性氧爆發(fā)前我們先用NAC預(yù)處理細(xì)胞，使其細(xì)胞內(nèi)NAC達(dá)到較高濃度以抑制活性氧的水平，檢測(cè)抑制活性氧對(duì)細(xì)胞存活率的影響。

圖2 還原劑NAC預(yù)處理對(duì)60 mmol/L甲酸處理后死亡率的影響

由圖2可見(jiàn)，和對(duì)照相比，2 mmol/L的NAC預(yù)處理明顯降低了死亡率，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)還原劑的增加，活性氧的抑制可降低甲酸處理后細(xì)胞的死亡率。有可能是由于NAC減少了活性氧，從而抑制了活性氧對(duì)酵母細(xì)胞的損傷。另外，使用PI染色后流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞膜完整性的方法也證明NAC預(yù)處理可以降低甲酸處理后的酵母細(xì)胞死亡率。

3.3 釀酒酵母線(xiàn)粒體活性對(duì)甲酸處理下細(xì)胞存活率的影響

在病理和生理?xiàng)l件下，通常線(xiàn)粒體都是活性氧的主要來(lái)源。線(xiàn)粒體電子傳遞鏈的障礙，往往導(dǎo)致活性氧的大量形成。而在不同遺傳性狀的釀酒酵母細(xì)胞中，或同一種細(xì)胞處在不同的生長(zhǎng)條件下，其線(xiàn)粒體活性往往有很大差異[10］。因此我們對(duì)不同類(lèi)型釀酒酵母細(xì)胞中活性氧的爆發(fā)及細(xì)胞死亡情況進(jìn)行了研究。

3.3.1 酵母細(xì)胞菌齡對(duì)甲酸處理時(shí)細(xì)胞死亡率的影響

和穩(wěn)定期細(xì)胞相比，對(duì)數(shù)期的酵母細(xì)胞代謝更為旺盛，其線(xiàn)粒體活性更高，因此我們推測(cè)同濃度甲酸在對(duì)數(shù)期酵母細(xì)胞中能導(dǎo)致更猛烈的活性氧爆發(fā)，從而對(duì)細(xì)胞造成更大的破壞，因此用甲酸處理培養(yǎng)24 h的穩(wěn)定期細(xì)胞時(shí)活性氧產(chǎn)生情況，并比較培養(yǎng)6 h的對(duì)數(shù)期細(xì)胞和培養(yǎng)24 h的穩(wěn)定期細(xì)胞在同濃度甲酸處理時(shí)的存活率。

由圖3可見(jiàn)，對(duì)數(shù)期細(xì)胞對(duì)甲酸的敏感程度比穩(wěn)定期細(xì)胞高得多，這在甲酸濃度較高時(shí)更為明顯。故甲酸的毒性和酵母細(xì)胞的代謝狀態(tài)密切相關(guān)。因此可以認(rèn)為，對(duì)數(shù)期細(xì)胞由于處于代謝旺盛的特點(diǎn)，其細(xì)胞內(nèi)較高活性的線(xiàn)粒體在甲酸處理下產(chǎn)生更多的活性氧，從而導(dǎo)致更多的對(duì)數(shù)期細(xì)胞死亡。

圖3 甲酸處理后對(duì)數(shù)期及穩(wěn)定期細(xì)胞的存活率比較

3.3.2 低溫預(yù)處理對(duì)甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率的影響

由于線(xiàn)粒體的產(chǎn)能速度和微生物細(xì)胞外環(huán)境密切相關(guān)，即細(xì)胞外因素會(huì)影響線(xiàn)粒體活性，因此我們推測(cè)低溫預(yù)處理降低線(xiàn)粒體活性后，再以甲酸處理細(xì)胞，這時(shí)線(xiàn)粒體活性氧爆發(fā)應(yīng)該減弱，細(xì)胞的死亡率應(yīng)該下降。故在加入甲酸之前，先將細(xì)胞置于4℃10 min，再將其和正常培養(yǎng)的對(duì)照樣品同時(shí)加入甲酸處理40 min，然后以標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法比較二者的存活率。在本實(shí)驗(yàn)中，我們還對(duì)另一實(shí)驗(yàn)室研究常用的釀酒酵母BY4741進(jìn)行了測(cè)定。

由圖4可見(jiàn)，短時(shí)間的低溫預(yù)處理，即可明顯提高甲酸處理后的細(xì)胞存活率。該結(jié)果也表明，甲酸誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和細(xì)胞的代謝狀態(tài)有關(guān)。

圖44℃預(yù)處理對(duì)60 mmol/L甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率的影響

3.3.3 線(xiàn)粒體呼吸缺陷對(duì)甲酸處理細(xì)胞存活率的影響

ATP酶結(jié)構(gòu)上的缺陷會(huì)影響其合成ATP的能力及線(xiàn)粒體的整體活性。所以我們通過(guò)敲除ATP酶亞基基因的方法，降低線(xiàn)粒體的活性，以期減弱甲酸誘導(dǎo)的活性氧的爆發(fā)并提高細(xì)胞存活率，并采用標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法對(duì)同濃度甲酸處理后野生型和ATP酶4亞基缺失株的存活率進(jìn)行了比較。

由圖5可見(jiàn)，線(xiàn)粒體缺陷會(huì)大大提高細(xì)胞的存活率，分析其原因，推測(cè)是在線(xiàn)粒體活性較低的情況下，甲酸誘導(dǎo)其產(chǎn)生的活性氧較少，故活性氧對(duì)細(xì)胞的破壞較小，所以細(xì)胞的存活率明顯上升。此外，我們還發(fā)現(xiàn)位于線(xiàn)粒體外膜的AIF基因缺失后，其線(xiàn)粒體膜電位會(huì)下降，同時(shí)細(xì)胞對(duì)甲酸的抗性也會(huì)增強(qiáng)(數(shù)據(jù)未列出)。

圖5 ATP酶亞基缺失對(duì)60 mmol/L甲酸處理細(xì)胞死亡率的影響

4 結(jié)論與討論

活性氧是指一些能和還原性物質(zhì)反應(yīng)的含氧化合物。正常生理情況下，超氧陰離子的生成由NAD(P)H氧化酶、黃嘌呤氧化酶參與，也可由線(xiàn)粒體內(nèi)電子傳遞鏈中的半醌類(lèi)化合物參與[11］，是線(xiàn)粒體內(nèi)形成的第一種活性氧。由于甲酸可以阻斷呼吸鏈，因此可以導(dǎo)致超氧陰離子的形成。超氧陰離子在線(xiàn)粒體內(nèi)產(chǎn)生后，可以在線(xiàn)粒體內(nèi)部或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)化成過(guò)氧化氫，因而在實(shí)驗(yàn)中可以用DCFH-DA檢出較高比例的活性氧陽(yáng)性細(xì)胞。在谷胱甘肽大量消耗的情況下，過(guò)氧化氫可破壞細(xì)胞成分，或進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成氧化性更強(qiáng)的羥自由基，對(duì)核酸等結(jié)構(gòu)產(chǎn)生致命的破壞。

正常細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生少量的活性氧，而一些細(xì)胞強(qiáng)毒性試劑如抑制細(xì)胞色素氧化酶的砷化物、氰化物可導(dǎo)致活性氧的快速大量產(chǎn)生。本文研究表明，甲酸處理會(huì)使細(xì)胞迅速產(chǎn)生超氧陰離子，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為細(xì)胞質(zhì)中其他類(lèi)型的活性氧。和穩(wěn)定期的細(xì)胞相比，對(duì)數(shù)期釀酒酵母細(xì)胞對(duì)甲酸更為敏感，死亡率更高;還原劑NAC短時(shí)間預(yù)處理，較低溫度預(yù)處理，敲除ATP酶的4亞基均可以降低細(xì)胞的死亡率。因此，降低甲酸處理下線(xiàn)粒體產(chǎn)生活性氧的能力可增強(qiáng)釀酒酵母細(xì)胞對(duì)甲酸的抗性。

因此，在深入研究甲酸毒性機(jī)理和抗性機(jī)制的基礎(chǔ)上，利用分子生物學(xué)方法，改變釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)甲酸作用的靶位點(diǎn)或生化過(guò)程，構(gòu)建線(xiàn)粒體呼吸鏈或其他線(xiàn)粒體膜蛋白的突變株，可獲得具有較強(qiáng)甲酸抗性的菌株。

[1]Laluce C，Schenberg A C.Advances and Developments in Strategies to Improve Strains of Saccharomyces cerevisiae and Processes to Obtain the Lignocellulosic Ethanol-A Review[J］.Appl Biochem Biotechnol，2012，166(8):1908-1926.

[2]Parawira W，Tekere M.Biotechnological strategies to overcome inhibitors in lignocellulose hydrolysates for ethanol production:review[J］.Crit Rev Biotechnol，2011，31(1):20-31.

[3]Akinori Matsushika，Hiroyuki?Inoue，Ethanol production from xylose in engineered Saccharomyces cerevisiae strains:current state and perspectives[J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84:37-53.

[4]陳捷敏，王立新，夏文濤.甲醇中毒機(jī)制的研究進(jìn)展[J］.法醫(yī)學(xué)雜志，2010，26(4)294-296.

[5]Nicholls P.Formate as an inhibitor of cytochrome c oxidase[J］.Biochem Biophys Res Commun，1975，67(2):610-616.

[6]Liesivuori J.Savolainen H.Methanol and formic acid toxicity:biochemical mechanisms[J］.Pharmacol Toxicol，1991，69(3):157-163.

[7]Hantson P E.Acute methanol intoxication:physiopathology，prognosis and treatment[J］.Bull Mem Acad R Med Belg，2005，160(5-6):294-300.

[8]Hantson P E.Acute methanol intoxication:physiopathology，prognosis and treatment[J］.Bull Mem Acad R Med Belg，2006，161(6):425-434.

[9]Du Lin，Su Yingying，Sun Dongbei，et al.Formic acid induces Yca1p-independent apoptosis-like cell death in the yeast Saccharomyces cerevisiae[J］.FEMS Yeast Research，2008(4):531-539.

[10]de Grey A D.Reactive oxygen species production in the mitochondrial matrix:implications for the mechanism of mitochondrial mutation accumulation[J］.Rejuvenation Res，2005，8(1):13-17.

[11]Lenaz G.The production of reactive oxygen species:mechanisms and implications in human pathology[J］.IUBMB Life，2001，52(3-5):159-164.

ABSTRACTBasing on the discovery that formic acid can inhibit the cytochrome oxidase which is located at the end of mitochondrial respiratory chain，and low concentration of formic acid can lead to the rapid outbreak of the reactive oxygen species which can kill yeast cells further，factors affecting the production of reactive oxygen species in Saccharomyces cerevisiae cells were studied.Effects of cell age，low-temperature，reducing agents pretreatment，and mitochondrial ATPase gene mutation to formic acid toxicity were analyzed.The results show that formic acid resistance of Saccharomyces cerevisiae is closely related to mitochondrial activity，reducing mitochondrial activity by mitochondrial mutation can enhance cellular resistance to formic acid.

Key wordsSaccharomyces cerevisiae，formic acid resistance，mitochondria，reactive oxygen species

Effect of Mitochondrial Activity to the Cell Survivla Rate of Saccharomyces cerevisiae After Formic Acid Treatment

Du Lin1，Li Lian2
1(Institute of Light Industry and Food Engineering，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510025，China)
2(School of Life Science，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China)

教授(E-mail:dulin2000@163.com)。

*廣東省產(chǎn)學(xué)研結(jié)合資助項(xiàng)目“廣東客家黃酒的發(fā)酵菌種研究與工業(yè)化應(yīng)用”。

2012-05-15，改回日期:2012-06-07