張瑜，繆銘，江波，張濤，劉苗

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

超高壓對脂肪酶活性及構(gòu)象的影響*

張瑜，繆銘，江波，張濤，劉苗

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

研究了壓力、保壓時間、pH值等對脂肪酶活性的影響，并且通過圓二色光譜和內(nèi)源熒光光譜研究了脂肪酶的構(gòu)象變化。結(jié)果表明，經(jīng)過70℃、pH 7.5、壓力200 MPa、保壓時間15 min的處理后，脂肪酶的酶活力比常壓對照提高了32%;200 MPa下，隨著保壓時間延長，脂肪酶活性較穩(wěn)定，相對酶活性均保持在120%以上;最適pH增加了0.5個單位。光譜分析顯示，高壓處理后，脂肪酶二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量明顯升高，β-折疊含量降低，內(nèi)源熒光中的色氨酸特征峰的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)10%～20%。

超高壓，脂肪酶，活性，構(gòu)象

近年來，隨著消費者對現(xiàn)代食品質(zhì)量要求的提高，非熱加工技術(shù)日漸發(fā)展起來。作為非熱加工技術(shù)之一，超高壓加工新技術(shù)在食品工業(yè)中有著很大的應(yīng)用前景。與熱加工不同，其在滅菌、加工的同時，可以保持新鮮食品的質(zhì)量，保持風(fēng)味和營養(yǎng)成分[1-3］。由于超高壓加工在食品工業(yè)中的應(yīng)用具有工藝簡單、操作安全、節(jié)約能源、綠色安全等特點，目前在日本、美國、歐洲等發(fā)達(dá)國家發(fā)展迅速，已經(jīng)有商業(yè)化的產(chǎn)品面市，主要有方便米飯、水果制品、奶制品及水產(chǎn)品等[2，4］。目前超高壓主要應(yīng)用在鈍化有害酶，其激酶作用也開始逐漸被科學(xué)家所關(guān)注[5］。Hayashi[6］等發(fā)現(xiàn)，壓力和溫度存在拮抗作用，在酶變性溫度下，壓力100～300 MPa對酶有保護(hù)作用。

脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3.)，在水溶液中能催化三酰甘油酯水解釋放脂肪酸、甘油二酯、單酰甘油酯和甘油，也可以在有機(jī)溶劑(如正己烷)或超臨界CO2中，催化甘油和脂肪酸生成單、雙、三甘油酯，廣泛用于乳制品加工(生產(chǎn)獨特風(fēng)味)、家用清潔用品、油脂化工、醫(yī)藥用途(肥胖癥和動脈硬化的治療)等領(lǐng)域[7］。微生物脂肪酶具有 1，3-鍵選擇性，可用于油脂的水解，能改變傳統(tǒng)油脂水解反應(yīng)產(chǎn)物脂肪酸顏色深、發(fā)生熱聚合和不適用于熱敏性油脂的不足[8］。

目前，光譜學(xué)被廣泛地應(yīng)用于蛋白構(gòu)象研究中，圓二色光譜和內(nèi)源熒光光譜是最常用的分析蛋白二、三級結(jié)構(gòu)的方法[9-10］。本文就超高壓對脂肪酶活性的影響進(jìn)行了研究，并通過圓二色光譜和內(nèi)源熒光光譜檢測等分析了酶蛋白結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

脂肪酶，丹麥諾維信公司;其他化學(xué)試劑均為化學(xué)分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

S-FL-085-09-W超高壓儀器，英國Stansted Fluid Power公司;Centriguge 5804R高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司;HAAKE SC 100循環(huán)水浴，美國Thermo Scientific公司;EWS30空壓機(jī)，浙江永源機(jī)電制造有限公司;MOS-450 AF-CD圓二色光譜儀，法國Biologic公司;熒光光譜儀，日本Hitachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪酶活性檢測方法

采用橄欖油乳化法[11］，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液中和滴定。1 mg酶粉于40℃、pH 7.5條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1μmol的脂肪酸，即為1個脂肪酶活力單位，以U/mg表示。本文中相對殘余酶活為At/A0，不作特別說明的話，A0為pH 7.5、溫度70℃、處理時間15 min的常壓酶活。

1.2.2 不同壓力對脂肪酶活性的影響

稱取脂肪酶0.3 g，溶于50 mL 0.05 mol/L的pH 7.5磷酸緩沖液，混勻，10000 r/min高速離心20 min后取上清液，分別在 0.1、50、100、150、200、250、300、350、400 MPa 下處理，時間為15 min，溫度為70℃，取出后立即根據(jù)脂肪酶活檢測方法檢測其活性。

1.2.3 不同保壓時間對脂肪酶活性的影響

稱取脂肪酶0.3 g，溶于50 mL 0.05 mol/L的pH7.5磷酸緩沖液，混勻，10000 r/min高速離心20 min后取上清液，在0.1和200 MPa下分別處理 5、10、15、30、60 min，溫度為 70℃，取出后立即根據(jù)脂肪酶活檢測方法檢測其酶活性。

1.2.4 不同pH值對脂肪酶的影響

配制 pH6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 的 0.05 mol/L磷酸緩沖液，稱取脂肪酶0.3 g，溶于50 mL上述不同pH磷酸緩沖液，混勻，10000 r/min高速離心20 min取上清液，分別在0.1和200 MPa、溫度為70℃下處理15 min，取出后立即根據(jù)脂肪酶活檢測方法檢測其活性。

1.2.5 圓二色光譜檢測

采用MOS-450 AF-CD圓二色光譜儀測定。以磷酸緩沖液為空白，掃描波長范圍為190～250 nm，掃描速度50 nm/min，溫度為25℃，重復(fù)掃描5次，記錄CD光譜。采用厚度0.1 cm的比色皿，分辨率為0.2 nm，譜帶寬度為1.0 nm，靈敏度為20 mdeg，響應(yīng)時間為0.25 s。圓二色性用平均殘基橢圓值[θ］表示，單位為(deg·cm2)/mol。并通過Dichroweb在線分析酶蛋白的二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元含量。

1.2.6 內(nèi)源熒光光譜檢測

超高壓處理前后的脂肪酶采用熒光光譜儀進(jìn)行內(nèi)源熒光檢測。以磷酸緩沖液為空白，激發(fā)波長為280 nm，掃描范圍300～600 nm，掃描速度為12000 nm/min，狹縫寬度為5 nm，PMT電壓為400 V，響應(yīng)時間0.1 s。相對熒光強(qiáng)度Ei/E0，E0為pH 7.5、溫度70℃、處理時間15 min的脂肪酶蛋白的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同壓力對脂肪酶活性的影響

70℃下，不同壓力對脂肪酶活性的變化見圖1。超高壓處理比在常壓下處理的酶活性均提高，在一定壓力范圍內(nèi)，相對酶活隨壓力增大緩慢上升，當(dāng)壓力為200 MPa時酶活達(dá)到最大值，較常壓下提高了32%，說明在一定壓力(50～250 MPa)內(nèi)，壓力的增加可使酶活性增高;當(dāng)壓力超過250 MPa后，相對酶活開始緩慢降低，但仍高于常壓下酶活。Marie-Olive等[12］也發(fā)現(xiàn)，在變性溫度下，50～350 MPa壓力能夠增提高殘余酶活，保護(hù)脂肪酶，50℃時殘余酶活從82%提高到95%，55℃時從32% 提高到70%，60℃時從0%提高到35%。當(dāng)壓力為150～250 MPa時，壓力的防護(hù)效果增大，同時，當(dāng)溫度從40℃增加到60℃，穩(wěn)定效果更加明顯。

圖1 不同壓力對脂肪酶活性的影響

酶的活性中心主要由非共價鍵維持，非共價鍵對壓力較為敏感。超高壓下，壓力作用于非共價鍵會引起酶活性中心結(jié)構(gòu)的改變，活性中心的這種變化會影響酶的催化活性[13］。由實驗結(jié)果可以得知，常壓下，脂肪酶在高溫下活性較低，是因為高溫使脂肪酶的空間構(gòu)象發(fā)生變化，發(fā)生了部分熱變性。當(dāng)有壓力存在時，壓力會阻止脂肪酶發(fā)生熱變性，使酶活性中心周圍構(gòu)象改變，來保護(hù)酶空間結(jié)構(gòu)，從而提高了酶的耐熱能力，穩(wěn)定性得到改善。

2.2 不同保壓時間對脂肪酶活性的影響

由圖2可知，當(dāng)處理壓力為常壓時，處理時間越長，越多的酶發(fā)生變性，活性呈現(xiàn)直線下降。高溫能弱化酶的氫鍵、離子鍵和靜電相互作用，活性中心結(jié)構(gòu)會發(fā)生不利變化，催化活性隨之降低。處理壓力為200 MPa時，脂肪酶活性隨保壓時間延長較穩(wěn)定，變化較慢，超高壓處理的酶活性均在120%以上，說明超高壓有抵抗脂肪酶熱變性的作用，反應(yīng)速度加快，酶的催化活性提高。在保壓時間為60 min時，酶活輕微反彈升高，有可能是因為在200 MPa壓力下，長時間的壓力使未解離的價鍵積累了能量，增強(qiáng)了酶活性中心的抗逆能力，釋放壓力后酶活性出現(xiàn)升高現(xiàn)象。

圖2 不同保壓時間對脂肪酶活性的影響

2.3 pH值對脂肪酶活性的影響

由圖3可以看出，常壓下，隨著pH值的增加，脂肪酶的穩(wěn)定性先上升后降低，最適pH值為7.5。而超高壓體系下，隨著pH的增加，脂肪酶的穩(wěn)定性在偏堿區(qū)較穩(wěn)定。pH 8.0時，脂肪酶的穩(wěn)定性最好。與常壓實驗條件相比，超高壓條件下，脂肪酶的最適pH值提高了0.5，且其耐堿性提高。酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，具有兩性解離特性，酶分子處于最佳pH值下，易抵抗外界熱變性和壓力變性。pH值發(fā)生改變后，會引起酶的活性中心變化，底物與酶活性中心結(jié)合力降低，反應(yīng)速度下降。超高壓處理可能導(dǎo)致酶分子結(jié)構(gòu)輕微變化，部分氨基酸端裸露，最適pH向堿性偏移，且最適pH值范圍變大，來維持酶的穩(wěn)定性。酶活性的測定是在常壓、pH 7.5的緩沖液中，且高壓處理的酶液體積在酶活測定體系中所占比例較小，對酶活測定體系的影響較小。且因高壓下處理的pH 7.5與pH 8.0的酶活性相差10%左右，為統(tǒng)一pH值，后續(xù)實驗均采用pH 7.5緩沖液。

圖3 超高壓對不同pH值脂肪酶活性的影響

2.4 圓二色(CD)光譜檢測

圓二色光譜是一種測量溶液中蛋白和多肽二級結(jié)構(gòu)的靈敏技術(shù)。蛋白質(zhì)圓二色光譜的遠(yuǎn)紫外區(qū)屬于肽鍵吸收范圍，反應(yīng)了蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象，能夠直接測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

圖4 脂肪酶在不同壓力作用下的圓二色譜圖

圖5 脂肪酶在不同保壓時間下的圓二色譜圖

表1 不同壓力對脂肪酶二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元含量的影響

表2 不同保壓時間對脂肪酶二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元含量的影響

通常典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)在208 nm和220 nm左右有2個負(fù)峰，典型的β-折疊在215 nm附近有1個負(fù)峰。由CD光譜圖可知，70℃、常壓下的脂肪酶在220 nm處基本無α-螺旋特征吸收，而通過高壓處理的脂肪酶在208 nm及220 nm均有吸收。由表1和表2可知，超高壓確實改變了脂肪酶蛋白的二級結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了α-螺旋的含量，降低了β-折疊的含量，無規(guī)則卷曲含量變化較小。相對應(yīng)酶活性的變化，說明脂肪酶的活性與α-螺旋和β-折疊所占的比例有重要的關(guān)系。由此推斷，α-螺旋含量升高和β-折疊含量降低將有助于酶活提高。Eisenmenger等[14］研究指出，與常壓相比，脂肪酶的活性在100～350 MPa較高，是由于活性部位周圍的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變使得酶和更多的底物相互作用。早期的X-射線衍射數(shù)據(jù)表明，脂肪酶的活性部位附近有1個由α-螺旋形成的“蓋子”。超高壓使α-螺旋增加，可防止活性中心受到損害，從而提高了相對酶活。

2.5 熒光光譜檢測

內(nèi)源熒光因其對蛋白分子中色氨酸殘基的微環(huán)境特別敏感而成為監(jiān)測蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的有力工具。為了進(jìn)一步確定超高壓對脂肪酶空間結(jié)構(gòu)中色氨酸殘基的改變，采用內(nèi)源熒光光譜檢測超高壓處理前后色氨酸殘基微環(huán)境的變化。

圖6 脂肪酶在不同壓力作用下的內(nèi)源熒光光譜圖

圖7 脂肪酶在不同保壓時間下的內(nèi)源熒光光譜圖

表3 不同壓力對脂肪酶內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響

表4 不同壓力對脂肪酶內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響

該脂肪酶蛋白是二聚體，分子量為30 ku，含269個氨基酸，每個分子含有15個苯丙氨酸(Phe)，10個酪氨酸(Tyr)和4個色氨酸(Trp)，屬于B類蛋白質(zhì)[15］。圖6是不同壓力處理后的熒光光譜圖，在343 nm左右有吸收峰，隨壓力的增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，結(jié)果表明超高壓處理影響了脂肪酶的三級結(jié)構(gòu)，使得更多色氨酸暴露出來，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。圖7是在0.1和200 MPa下不同時間處理脂肪酶的熒光光譜圖，超高壓作用提高了脂肪酶內(nèi)源熒光強(qiáng)度，而且隨著高壓作用時間的增加，這種效應(yīng)更加明顯，并且存在著非線性的關(guān)系。表明了其活性部位的發(fā)光氨基酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生變化，從而影響其二級結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步可能會影響它的活性和穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

(1)在70℃、pH 7.5、15 min 條件下，經(jīng)過高壓處理的酶活比常壓下酶活高，在200 MPa處理的酶活最高，比常壓下提高了32%;在70℃下，壓力為200 MPa時，脂肪酶活性變化較慢，但壓力抵抗酶熱變性明顯，超高壓處理的酶活性均在120%以上;高壓下比常壓下最適pH值提高了0.5個單位。

(2)高壓使得酶蛋白的α-螺旋含量顯著升高，β-折疊含量降低。高壓處理后脂肪酶的內(nèi)源熒光中的色氨酸特征峰的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，增強(qiáng)范圍在10%～20%。說明高壓作用與酶蛋白的二三級結(jié)構(gòu)變化有一定的關(guān)系，從而為高壓提高酶的熱穩(wěn)定性提供了理論依據(jù)。

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ABSTRACTThe paper reported the effects of the pressure，the dwell time and pH on the lipase activity，and focused on the changes of the lipase conformation through the Circular Dichroism(CD)spectroscopy and endogenous fluorescence spectroscopy.The main results were discussed as follows:In comparison with atmospheric pressure，the lipase activity under 200 MPa was increased by 32%at 70℃，pH7.5，15 min:With the extension of the dwell time，the lipase activity was stabilized，and the relative activities stayed above 120%.The optimal pH increased by 0.5.CD spectroscopy revealed that after high pressure treatment the secondary structure of lipase had changed，α-helix content increased significantly，β-sheet content decreased and endogenous fluorescence spectroscopy showed tryptophan characteristic peak rised by 10%～20%.

Key wordsultra high pressure，lipase，activity，conformation

The Effects of Ultra High Pressure on the Activity and Conformation of Lipase

Zhang Yu，Miao Ming，Jiang Bo，Zhang Tao，Liu Miao
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

碩士研究生(江波教授為通訊作者)。

*國家自然科學(xué)基金項目(20976073);江蘇省自然基金創(chuàng)新學(xué)者攀登項目(BK2008003);江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室目標(biāo)導(dǎo)向資助項目(SKLF-MB-200804)

2011-12-21，改回日期:2012-04-05