王彩瀾，劉新育，李學(xué)琴，劉亮偉，陳紅歌

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州，450002)

酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)*

王彩瀾，劉新育，李學(xué)琴，劉亮偉，陳紅歌

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州，450002)

酸性α-淀粉酶是發(fā)酵行業(yè)用量最大的酶類，為了實(shí)現(xiàn)酸性α-淀粉酶基因的高效表達(dá)，將本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆得到的去信號肽的酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌WB600宿主中進(jìn)行表達(dá)，成功的構(gòu)建了表達(dá)菌株pHT43－amy/WB600。在初始菌濃度OD600為0.8時加入終濃度為0.9 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)6 h的條件下測得酶活力為1 230 U/mL，又由于宿主菌WB600外分泌蛋白較s少，因此具有明顯的生產(chǎn)優(yōu)勢。

酸性α-淀粉酶基因，高效表達(dá)，枯草芽孢桿菌

α-淀粉酶(1，4-α-D-葡萄糖苷水解酶，EC 3.2.1.1)能夠以淀粉為底物，從淀粉內(nèi)部水解1，4-α-D-葡萄糖苷鍵，α-淀粉酶在淀粉加工以及味精、氨基酸、抗生素、乙醇等以淀粉為原料的發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)中具有重要的用途。酸性α-淀粉酶是指在較低 pH條件下(pH 4.0～5.0)仍能保持高酶活性的α-淀粉酶，作為一種極端環(huán)境淀粉酶在淀粉加工中顯示出更大的應(yīng)用價(jià)值。

目前，酸性α-淀粉酶尚沒有工業(yè)產(chǎn)品，對酸性α-淀粉酶的研究多集中在產(chǎn)酶菌株篩選、異源高效表達(dá)等方面?？莶輻U菌是發(fā)酵工業(yè)中的常用菌種，對人畜安全，是美國食品藥物管理局(FDA)和中國農(nóng)業(yè)部均批準(zhǔn)使用的安全菌株。更為重要的是，外源基因在枯草芽孢桿菌中是分泌性表達(dá)，產(chǎn)物便于提取和純化，這是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)不可比擬的，因此枯草芽孢桿菌是極具潛力的基因工程宿主菌［1－2］。目前已有來自側(cè)孢短芽孢桿菌堿性蛋白酶基因BLG4基因［3］﹑甘露聚糖酶基因 Man23［4］、耐高溫 α-淀粉酶基因［5］等在枯草芽孢桿菌中得以高效表達(dá)。

本課題組先期已得到1株產(chǎn)酸性α-淀粉酶菌株——解淀粉芽孢桿菌B-5，其最適pH值為5.0，并克隆 該 酸 性 α-淀 粉 酶 基 因，NCBI登 錄 號GU318401［6］。為獲得該酸性α-淀粉酶基因的異源高效表達(dá)工程菌，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了該基因在枯草芽孢桿菌中的重組表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化后，通過對工程菌株誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，以期獲得高活力酸性α-淀粉酶菌株，為酸性α-淀粉酶的實(shí)際應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

JM109，枯草芽孢桿菌WB600和pHT43質(zhì)粒載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存，pMD－19T－simple來自TaKa-Ra。

1.1.2 酶和試劑

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SmaⅠ，ExTaq酶，Premix EX Taq Version2.0，Rnase，T4 DNA Ligase，氨芐青霉素 Amp，氯霉素 Cm，IPTG，DL2000 DNA Marker，λHindⅢ DNA Marker，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)，DNA凝膠回收試劑盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit 2.0)等為 TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌和大腸桿菌所用的培養(yǎng)基均為LB培養(yǎng)基。在需要的時候分別加入100 μg/mL的氨芐和10 μg/mL的氯霉素，10 μg/mL的氯霉素用于重組枯草桿菌的篩選。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒DNA的快速提取

按照參考文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。

1.2.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

按照參考文獻(xiàn)［8－9］進(jìn)行。

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)一對引物P1(5’－CGCGGATCCGAAACTGCAAACAAATC －3’)和 P2(5’－TCCCCCGGGTTAATGCGGAAGAT－3’)，引物P1和P2中分別引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和SmaⅠ，見下劃線。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。以實(shí)驗(yàn)室保存的pET21a－amy質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出去信號肽的amy基因。PCR擴(kuò)增出來的片段純化回收之后進(jìn)行雙酶切，與同樣進(jìn)行雙酶切的pHT43在4℃進(jìn)行酶連。構(gòu)建出重組表達(dá)載體pHT43－amy。重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，在含有100 μg/mL的AMP的平板上進(jìn)行篩選。從JM109轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒進(jìn)行重組質(zhì)粒的鑒定。

1.2.4 表達(dá)菌株pHT43－amy/WB600的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pHT43-amy轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細(xì)胞中，在10 μg/mL的氯霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。將這些轉(zhuǎn)化子挑到加有氯霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min過夜培養(yǎng)，然后37℃，200 r/min誘導(dǎo)，測酸性α-淀粉酶活力，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測外源蛋白。

1.2.5 酸性α-淀粉酶表達(dá)條件的優(yōu)化

將陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)14 h，之后加入1 mmol/L IPTG 進(jìn)行分時段誘導(dǎo)(0、1、2、3、4、5、6、7、8 h)，通過酸性α-淀粉酶活力測定和外源蛋白表達(dá)量確定最佳誘導(dǎo)時刻。采用同樣的分析方法優(yōu)化IPTG的使用濃度和誘導(dǎo)時的最佳菌體濃度。

將100 mL的發(fā)酵液在5 000 g×5 min條件下離心，上清酶液保存，菌體沉淀用pH 5.0的檸檬酸－磷酸緩沖液洗滌2次，之后加入5 mL檸檬酸－磷酸緩沖液，采用200 W、10 min(工作10 s、間歇30 s、60 次)超聲波破碎菌體，離心之后取上清，并定容至100 mL。

1.2.7 酸性α-淀粉酶活力測定

取10 mL的底物溶液放入1個試管，55℃水浴保溫10 min后加入粗酶液1 mL，混勻，精確保溫10 min，吸取0.5 mL混合液，加入盛有10 mL 0.1 mol/L的HCl的試管中，然后再取該混合液0.5 mL，加入盛有10 mL的碘液試管中搖勻，用分光光度計(jì)于660 nm下測定吸光值。對照管用同樣的方法測得，只是將粗酶液事先于沸水中10 min后再加入，以蒸餾水作為比色的參比。

酶活力單位:在上述條件下，反應(yīng)10 min使1%淀粉溶液顯藍(lán)強(qiáng)度減低1%所需酶量為1個酶活力單位(U)［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體pHT43－amy的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增出來的帶有BamHⅠ和SmaⅠ酶切位點(diǎn)的去信號肽的amy基因進(jìn)行雙酶切，與同樣經(jīng)雙酶切的pHT43質(zhì)粒在4℃進(jìn)行酶連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR驗(yàn)證(如圖1a)、雙酶切驗(yàn)證(如圖1b)，證明amy基因已經(jīng)重組至pHT43載體上，將該重組質(zhì)粒記作pHT43－amy。

吸附等溫線：準(zhǔn)確稱取已預(yù)處理樹脂5.0 g于錐形瓶中，加入不同濃度的花色苷溶液各50 mL，置于振蕩器30 ℃、100 r/min上下振蕩3 h，待吸附平衡后測定溶液的平衡質(zhì)量濃度，并計(jì)算吸附量，以吸附量對濃度作圖，繪制吸附等溫曲線。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證及雙酶切驗(yàn)證

2.2 枯草桿菌重組菌株的構(gòu)建

在實(shí)驗(yàn)中我們選取枯草芽孢桿菌WB600為受體菌，它是6種蛋白酶基因缺陷型菌株，能將重組蛋白分泌到胞外，便于分離提純，沒有密碼子偏愛性［11］。將重組質(zhì)粒pHT43－amy轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞WB600中，挑取其中10個陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酸性α-淀粉酶活力檢測，結(jié)果顯示其中1個轉(zhuǎn)化子是假陽性，而其它9個轉(zhuǎn)化子具有相同的酸性α-淀粉酶活力水平，約為1 200 U/mL。選取4號轉(zhuǎn)化子作為后續(xù)試驗(yàn)的研究材料。對4號菌株進(jìn)行SDS-PAGE檢測，如圖2所示，可知在約66 ku處出現(xiàn)預(yù)期大小的酸性α-淀粉酶基因的表達(dá)蛋白，通過Quantity One軟件分析可知，該外源蛋白可占重組枯草桿菌胞外蛋白的80% 以上。

圖2 重組菌株pHT43－amy/WB600粗酶液的SDS-PAGE

2.3 重組枯草桿菌酸性α-淀粉酶表達(dá)條件的優(yōu)化

2.3.1 誘導(dǎo)時間對酸性α-淀粉酶表達(dá)量的影響

將重組枯草桿菌培養(yǎng)至OD600為1.0時，加入終濃度為1 mmo/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng)不同誘導(dǎo)時間的培養(yǎng)后，取出培養(yǎng)液，離心獲得粗酶液進(jìn)行酸性α-淀粉酶活力測定(圖3)和SDS-PAGE檢測(圖4)?？梢钥闯?，在誘導(dǎo)6 h時酸性α-淀粉酶活力已達(dá)最高，繼續(xù)誘導(dǎo)至8 h，酶活力沒有增加，SDS-PAGE也顯示在誘導(dǎo)6～8 h之間外源蛋白表達(dá)量沒有明顯差異，因此后續(xù)試驗(yàn)采用6 h的誘導(dǎo)時間。

圖3 誘導(dǎo)時間對重組菌株酸性α-淀粉酶活力的影響

圖4 不同誘導(dǎo)時間對酸性α-淀粉酶表達(dá)量的影響

2.3.2 誘導(dǎo)的起始菌濃度對酸性α-淀粉酶表達(dá)的影響

分別在菌體濃度 OD600為 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4時加入1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h后，比較其酸性α-淀粉酶活力，結(jié)果如圖5所示?？芍贠D600為0.8時誘導(dǎo)產(chǎn)生的酸性α-淀粉酶活力最高，進(jìn)行 SDSPAGE檢測(如圖6)，通過Quantity One軟件分析可知OD600為0.8時的外源蛋白表達(dá)量最大，因此認(rèn)為該重組菌在OD600為0.8時開始誘導(dǎo)最佳。

2.3.3 IPTG濃度對酸性α-淀粉酶表達(dá)的影響

將重組枯草桿菌培養(yǎng)至 OD600為0.8，分別加入0.5～1.6 mmol/L(間隔0.1 mmol/L)不同濃度的IPTG，培養(yǎng)6 h后，檢測不同IPTG濃度對酸性α-淀粉酶活力和表達(dá)量的差異，結(jié)果如圖7、圖8所示。盡管酸性α-淀粉酶活力測定顯示IPTG濃度為0.9 mmol/L時活力最高，但SDS-PAGE顯示不同濃度IPTG誘導(dǎo)下外源蛋白表達(dá)量差異并不明顯，說明IPTG濃度對酸性α-淀粉酶的表達(dá)沒有顯著影響，出于經(jīng)濟(jì)投入節(jié)省成本考慮，后續(xù)試驗(yàn)可選擇0.5 mmol/L的IPTG濃度進(jìn)行該酸性α-淀粉酶的誘導(dǎo)表達(dá)。

圖5 不同菌體濃度誘導(dǎo)時酸性α-淀粉酶活力的變化

圖6 不同菌體濃度誘導(dǎo)對酸性α-淀粉酶表達(dá)量的影響

圖7 不同IPTG濃度對酸性α-淀粉酶活力的影響

2.4 外源酸性α-淀粉酶的分泌情況

為了探究酸性α-淀粉酶在重組枯草桿菌中的分泌情況，用250 mL的三角瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)了100 mL菌液，先離心獲得胞外酶組分，又將菌體沉淀用pH 5.0的檸檬酸－磷酸緩沖液洗滌2次之后，加入5 mL緩沖液進(jìn)行超聲波破碎，取上清定容至100 mL，此為胞內(nèi)酶組分。分別測定以上2組分的酸性α-淀粉酶活力，結(jié)果如表1所示。可知重組枯草桿菌所表達(dá)的酸性α-淀粉酶有98%以上都分泌到了胞外。

圖8 不同IPTG濃度對酸性α-淀粉酶表達(dá)量的影響

表1 酸性α-淀粉酶的分泌情況

3 結(jié)論與討論

本研究成功地將解淀粉芽孢桿菌酸性α-淀粉酶基因amy在枯草芽孢桿菌WB600中表達(dá)，通過對重組菌株表達(dá)條件的優(yōu)化，當(dāng)菌體濃度OD600達(dá)到0.8時，用0.9 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，酸性α-淀粉酶酶活力高達(dá)1 230 U/mL，是原始菌株α-淀粉酶酶活力360 U/mL的3倍，顯示出更大的工業(yè)應(yīng)用潛力。

本實(shí)驗(yàn)得到的重組枯草芽孢桿菌表達(dá)的酸性α-淀粉酶98%以上都分泌到了胞外;同時，從胞外總蛋白的表達(dá)情況來看，雜蛋白較少，外源α-淀粉酶量可占胞外總蛋白量的80%以上，從而使目的蛋白易于被純化。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)該重組菌粗酶液可在4℃下存放3個月而酶活力沒有下降，證明該酶液組分不易被降解，具有良好的穩(wěn)定性，這些特性都極有利于酸性α-淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

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High-level Expression of Acid-stable α-amylase Gene of Bacillus amyloliquefaciens in Bacillus subtilis WB600

Wang Cai-lan，Liu Yu-xin，Li Xue-qin，Liu Liang-wei，Chen Hong-ge
(Key Laboratory of Enzyme Engineering of Agricultural Microbiology，Ministry of Agriculture，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China)

Acid-stable α-amylase is widely used in fermentation industry.In order to highly express acid-stable α-amylase gene，a recombinant vector containing no signal peptide of acid-stable α-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens was constructed followed by transformation into Bacillus subtilis WB600host.The highest activity of recombinant acid-stable α-amylase was 1230 U/mL under the condition as follows:OD600 of the initial bacteria was 0.8 and final concentration of IPTG was 0.9 mmol/L，and the cell suspension was cultured for 6 hours after addition of IPTG.As the recombinant Bacillus subtilis WB600 secreted few other proteins except the targeted acid-stableα-amylase，it showed obvious advantages in amylase production.

acid-stable α-amylase gene，high level expression，Bacillus subtilis

碩士研究生(陳紅歌教授為通訊作者)

*河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃(2010A180006)

2011－12－13，改回日期:2012－03－31