代偉麗，王艷萍，王菁蕊，白小佳

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

重組質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp在乳酸菌中的應(yīng)用

代偉麗，王艷萍，王菁蕊，白小佳

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

本研究將帶有nisI和gfp(綠色熒光蛋白)基因的乳酸菌表達(dá)載體pMG36e-nisI-gfp轉(zhuǎn)化至乳酸菌中，觀察其在宿主內(nèi)的穩(wěn)定性．對(duì)重組菌進(jìn)行了菌體形態(tài)、傳代培養(yǎng)、質(zhì)粒驗(yàn)證等研究，考察了該質(zhì)粒的穩(wěn)定性．結(jié)果顯示：重組菌在不含抗生素的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代20代后，質(zhì)粒丟失率低；菌體大小和形態(tài)基本不變；質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ酶切后大小不變；GFP在第0、5、10、15和20代宿主菌中都可以表達(dá)，表達(dá)量沒(méi)有明顯差別，在SDS-PAGE中的帶型一致；初步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該質(zhì)粒作為遺傳標(biāo)記的應(yīng)用效果．說(shuō)明該質(zhì)粒在宿主菌中具有良好的穩(wěn)定性．

綠色熒光蛋白；乳酸菌；質(zhì)粒穩(wěn)定性

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類能利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性桿菌或球菌，厭氧或兼性厭氧，是不能還原硝酸鹽的一類細(xì)菌的總稱[1].乳酸菌長(zhǎng)期應(yīng)用于食品發(fā)酵、生物醫(yī)藥工業(yè)，是被公認(rèn)為安全的食品級(jí)微生物(generally regarded as safe，GRAS)．乳酸菌與人類生活密切相關(guān)，常見(jiàn)于肉類、奶油及蔬菜發(fā)酵制品中，能通過(guò)胃并定植于腸道發(fā)揮益生作用，如免疫調(diào)節(jié)[2]、對(duì)致病菌的拮抗作用[3]、降低血清膽固醇含量及預(yù)防心血管疾病[4]．但對(duì)其在體內(nèi)的定植規(guī)律及在腸道微生物菌群中的作用研究較少．

本實(shí)驗(yàn)室前期從西藏Kefir粒中分離出來(lái)多株具有優(yōu)良性狀的乳酸菌[5-7]，并經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化及16S rDNA分子生物學(xué)鑒定．本文將實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的一種乳酸菌表達(dá)載體pMG36e-nisI-gfp[8]，以nisI基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，綠色熒光蛋白gfp基因?yàn)閳?bào)告基因，對(duì)該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至不同乳酸菌中進(jìn)行初步研究，以確定該質(zhì)粒的宿主范圍、穩(wěn)定性及作為遺傳標(biāo)記的應(yīng)用效果，為研究乳酸菌在體內(nèi)的定植規(guī)律奠定一定的基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

菌株：植物乳桿菌MA2(Lactobacillus plantarumMA2)、乳酸乳球菌WH-C1(Lactococcus lactisWHC1)和嗜熱鏈球菌34(Streptococcus thermophilus34)由本實(shí)驗(yàn)室分離及保藏；乳酸菌表達(dá)載體pMG36enisI-gfp由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[8]并保存．

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0,g，牛肉膏10.0,g，酵母膏5.0,g，葡萄糖20.0,g，磷酸氫二鉀 2.0,g，醋酸鈉5.0,g，硫酸鎂0.2,g，硫酸錳0.05,g，檸檬酸銨2.0,g，吐溫80 1.0,g，加蒸餾水定容至1,000,mL，瓊脂粉20,g，pH 6.2～6.4，121,℃滅菌20,min．

紅霉素在MRS-Ery＋-nisin＋培養(yǎng)基中工作濃度為2.5,μg/mL，Nisin的工作濃度為20,IU/mL．

1.2 試劑與儀器

紅霉素，Bio Basic公司；Nisin，Sigma公司；限制性內(nèi)切酶HindⅢ，F(xiàn)ermentas公司．

SCIENTZ-ⅡD型細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司．

1.3 質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp的宿主范圍

將乳酸菌表達(dá)載體pMG36e-nisI-gfp分別轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌WH-C1、植物乳桿菌MA2及嗜熱鏈球菌34中，初步研究重組質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp的宿主范圍．

1.4 菌株傳代方法

取對(duì)數(shù)期至穩(wěn)定期的重組菌，37,℃培養(yǎng)12,h，以2%的接種量接入新鮮不含抗生素的液體MRS培養(yǎng)基中，每傳1次記為1代．傳代20代后，梯度稀釋，分別涂布于含有和不含抗生素的MRS平板上，菌落計(jì)數(shù)，研究質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp在重組菌中的穩(wěn)定性．質(zhì)粒穩(wěn)定性以MRS-Ery＋-nisin＋固體培養(yǎng)基上的菌落數(shù)占MRS-Ery--nisin-固體培養(yǎng)基的菌落數(shù)的比率來(lái)評(píng)定．

1.5 質(zhì)粒PCR鑒定

傳代過(guò)程中，取第0、5、10、15、20代菌液，堿裂解法提取質(zhì)粒．進(jìn)行nisI基因(NisI-up：5′-AGATCT AGACAGGAGGGAAGAGGAAATGAG-3′和NisI-down：5′-CGTCTGCAGTTAGGATCCCTATTTCCTA C-3′)和gfp基因(GFP-up：5′-GCGAGCTCTGAGTA AAGGAGAAGAACT-3′和GFP-down：5′-GCTCT AGACGCGGTACCTTTGTATAG-3′)的PCR擴(kuò)增，電泳鑒定PCR片段．

1.6 質(zhì)粒酶切鑒定

傳代過(guò)程中，取第0、5、10、15、20代菌液，堿裂解法提取質(zhì)粒．取4,μL用限制性內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行酶切，37,℃反應(yīng)2,h，電泳鑒定酶切片段．

1.7 GFP在宿主菌中的表達(dá)

傳代過(guò)程中，取第0、5、10、15、20代菌液，擴(kuò)大培養(yǎng)，37,℃培養(yǎng)36,h，取20,mL于10,℃、5 000,r/min離心1,min，棄上清液；用7,mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.4)配成菌懸液[9]，10,℃、5 000,r/min離心5,min；菌體用7,mL磷酸鹽緩沖液重懸；在細(xì)胞破碎儀中超聲波破碎，工作時(shí)間為7,min，工作/間歇為2,s/2,s，甲醇法抽提蛋白，SDS-PAGE電泳觀察GFP的表達(dá)情況．

1.8 質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp作為遺傳標(biāo)記的應(yīng)用效果

活化重組菌，使菌液濃度達(dá)到大約109,mL–1；小鼠灌胃之前，過(guò)夜禁食、禁水，每只小鼠灌胃1,mL重組菌，空白對(duì)照組灌胃生理鹽水；一定時(shí)間后，進(jìn)行宰殺、解剖，取胃、空腸、回腸和盲腸組織，制作切片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察．

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp的宿主范圍

質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp在乳酸乳球菌WH-C1、植物乳桿菌MA2及嗜熱鏈球菌34中都能轉(zhuǎn)化成功，說(shuō)明該乳酸菌表達(dá)載體pMG36e-nisI-gfp具有一定的宿主適用范圍．

MRS-Ery＋-nisin＋固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)36,h的重組菌菌落為直徑1～2,mm的圓形隆起，表面濕潤(rùn)光滑，白色，邊緣整齊，為典型的乳酸菌菌落形態(tài)．第0、5、10、15、20代重組菌株的菌體及菌落形態(tài)變化不大，且與野生菌株相比沒(méi)有明顯差別．

2.2 質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp的質(zhì)粒穩(wěn)定性

連續(xù)傳代20代后，乳酸乳球菌WH-C1、植物乳桿菌MA2及嗜熱鏈球菌34在MRS-Ery＋-nisin＋和MRS-Ery--nisin-固體培養(yǎng)基中菌落數(shù)的數(shù)量級(jí)相同；表1中，重組植物乳桿菌MA2的質(zhì)粒丟失率僅為2.46%，說(shuō)明乳酸菌表達(dá)載體pMG36e-nisI-gfp的質(zhì)粒穩(wěn)定性良好．

2.3 質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp的PCR鑒定

堿裂解法提取第0、5、10、15、20代重組菌的質(zhì)粒，分別擴(kuò)增nisI和gfp基因．

幾株重組菌的質(zhì)粒驗(yàn)證圖大致相同，下面以重組植物乳桿菌MA2為例進(jìn)行介紹．圖1中 780,bp左右的nisI片段和圖2中750,bp左右的gfp片段，均與理論值相符；Image Lab軟件及SPSS軟件中的一維方差分析顯示，電泳條帶亮度之間差異不顯著，證明了質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp的穩(wěn)定性．

表1 重組菌傳代20代后的菌落數(shù)Tab. 1 The CFU of the recombinants of the 20th generation during the subculture mL-1

圖1 重組菌MA2第0、5、10、15、20代質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp的nisI基因PCR圖Fig. 1 PCR of nisI gene of the primary and the 5th，10th，15th and 20th generations

圖2 重組菌MA 2第0、5、10、15、20代質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp的gfp基因PCR圖Fig. 2 PCR of gfp gene of the primary and the 5th，10th，15th，and 20th generations of recombined Lb. plantarum MA2

2.4 質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp的酶切鑒定

提取第0、5、10、15、20代重組菌的質(zhì)粒，HindⅢ酶切后，圖3中均可見(jiàn)約5,100,bp的片段，進(jìn)一步說(shuō)明了質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp的穩(wěn)定性．

圖3 重組菌MA2第0、5、10、15、20代質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp的酶切鑒定Fig. 3 Restriction of plamids of the primary and the 5th，10th，15th，and 20th generations of recombined Lb. plantarum MA2

2.5 GFP在宿主菌中的表達(dá)

GFP的理論相對(duì)分子質(zhì)量約為2.7×104．以取第0、5、10、15、20代菌液，超聲波破碎后，用甲醇法抽提蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(圖4)．Image Lab軟件及SPSS軟件中的一維方差分析顯示，電泳條帶亮度之間差異不顯著，驗(yàn)證了質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp的穩(wěn)定性．

圖4 重組菌MA2第0、5、10、15、20代質(zhì)粒表達(dá)GFP的蛋白電泳Fig. 4 SDS-PAGE of the primary and 5th，10th，15th，and 20th generations of recombined Lb. plantarum MA22.6 質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp作為遺傳標(biāo)記的應(yīng)用效果

乳酸乳球菌是乳酸菌的模式菌株，將重組乳酸乳球菌WH-C1/pMG36e-nisI-gfp灌胃小鼠．灌胃后于不同時(shí)間宰殺，取胃腸道的不同部位，制片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖5所示．灌胃重組菌小鼠的胃腸道中可以看到明顯的熒光，而對(duì)照組則看不到熒光，證明質(zhì)粒pMG36e-nisI-gfp可以作為一種遺傳標(biāo)記，以便于接下來(lái)研究乳酸菌在胃腸道中發(fā)揮益生作用的機(jī)理．

圖5 重組乳酸乳球菌WH-C1在胃腸道中的熒光顯微圖Fig. 5 Pictures of the recombined L. lactis WH-C1 in the gastrointestinal tract

3 結(jié) 語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)將乳酸菌表達(dá)載體pMG36e-nisI-gfp成功轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌WH-C1、植物乳桿菌MA2及嗜熱鏈球菌34中，說(shuō)明該質(zhì)粒有很好的宿主適用范圍；傳代培養(yǎng)20代后，質(zhì)粒丟失率較低；傳代后的重組菌與野生菌相比大小和形態(tài)基本不變；質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切驗(yàn)證后，大小不變，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；GFP在第0、5、10、15和20代宿主菌中都可以表達(dá)，表達(dá)量沒(méi)有明顯差別，表達(dá)產(chǎn)物在SDS-PAGE中的帶型一致，都表明該質(zhì)粒在宿主菌中具有良好的穩(wěn)定性；初步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該質(zhì)粒在乳酸菌中作為遺傳標(biāo)記的應(yīng)用效果．綜上，乳酸菌表達(dá)載體pMG36e-nisI-gfp具有很好的穩(wěn)定性，并且可以作為一種遺傳標(biāo)記，為以后研究乳酸菌在動(dòng)物腸道中的分布和黏附定植規(guī)律奠定了基礎(chǔ)，更有利于闡明乳酸菌制劑在動(dòng)物腸道中發(fā)揮益生作用的機(jī)理．

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責(zé)任編輯：郎婧

Application of Recombined Plasmid pMG36e-nisI-gfp in Lactic Acid Bacteria

DAI Weili，WANG Yanping，WANG Jingrui，BAI Xiaojia
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

A constitutive expression vector for lactic acid bacteria，named pMG36e-nisI-gfp，was constructed first，usingnisIas the selection marker and GFP as the reporter protein. In this work，the expression vector was electroporated into some LABs and its plasmid stability was evaluated. The results showed that the loss rate of the plasmid strains harboring pMG36enisI-gfpwas still low even after 20,generations during the subculture in a liquid culture medium without antibiotics. The size and shape of the recombined strain did not change before and after subculture. The expression of GFP in the 0th，5th，10th，15th,and 20th,generations showed no significant difference. The effect of pMG36e-nisI-gfpas a reporter protein was proved in animal experiments. It was concluded that the plasmid pMG36e-nisI-gfphad good stability.

green fluorescent protein；lactic acid bacteria；plasmid stability

Q782

：A

：1672-6510(2012)03-0006-04

2011–12–12；

2012–03–16

“十二五”科技部高科技發(fā)展研究計(jì)劃(863計(jì)劃)(2011AA100904)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20091208110001)

代偉麗（1984—），女，河北保定人，碩士研究生；通信作者：王艷萍，教授，ypwang@tust.edu.cn.