袁 鶴，沈志紅，楊麗麗，李 凱

（山西舜天農(nóng)業(yè)微生物科學(xué)技術(shù)研究院，山西陽(yáng)泉045000）

番茄早疫病又稱(chēng)輪紋病，是由茄鏈格孢菌（Alternaria solani）所導(dǎo)致的一種番茄重要病害之一，也是一種世界性病害。其在美國(guó)、澳大利亞、印度、希臘等地發(fā)病率都很高，嚴(yán)重時(shí)可使產(chǎn)量損失35%～78%[1]。番茄早疫病在我國(guó)河北、山西、黑龍江、湖北、江蘇、浙江等大部分地區(qū)也普遍發(fā)生，為害日趨嚴(yán)重。目前，全國(guó)各地均有發(fā)生，已經(jīng)成為露地、保護(hù)地番茄生產(chǎn)中的主要病害，對(duì)番茄產(chǎn)量影響很大，一般減產(chǎn)30%左右，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%以上[2]。

目前，生產(chǎn)上通常使用百菌清、敵克松、多菌靈等化學(xué)藥劑對(duì)番茄早疫病進(jìn)行防治?；瘜W(xué)防治是控制早疫病的有效方法，具有見(jiàn)效快、殺菌譜廣、成本低、使用簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[3]，但化學(xué)殺菌劑的長(zhǎng)期反復(fù)大量使用會(huì)引起其自身在土壤和作物上的殘留，對(duì)土壤、地下水、大氣造成污染，破壞生態(tài)平衡，尤其給子孫后代的生存、健康帶來(lái)威脅。隨著近年來(lái)人們對(duì)環(huán)境問(wèn)題的日益關(guān)注和對(duì)綠色食品的需求，生物防治以其高效且無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)污染、不產(chǎn)生抗藥性的特點(diǎn)越來(lái)越受到研究者的重視。

放線菌是產(chǎn)生農(nóng)用抗生素的重要生物資源，其在植物病害生物防治中具有很好的應(yīng)用前景[4]。尋找和篩選拮抗番茄早疫病的生防菌是早疫病防治的重要工作。

本研究以番茄早疫病菌為靶標(biāo)病原菌，從不同感病番茄的田間土壤中篩選拮抗作用強(qiáng)的放線菌，以期為番茄早疫病的生物防治提供具有生防效果的菌株。

1 材料和方法

1.1 材料

供試放線菌分離自番茄栽培地土壤（陽(yáng)泉市平定縣南坪村）。供試的番茄早疫病菌由河北省科學(xué)院提供。放線菌的分離和保存采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，拮抗放線菌株的篩選及病原菌株的培養(yǎng)均采用馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）。

1.2 方法

1.2.1 土壤中放線菌的分離與純化 將采自番茄栽培地的土樣自然風(fēng)干，過(guò)0.25 mm篩[5]，稱(chēng)取5 g烘干的土壤樣品，置于盛有45 mL無(wú)菌水的三角瓶中，充分振蕩，靜置10 min，采用平板梯度稀釋法分離放線菌。于高氏一號(hào)培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)5～7 d，根據(jù)菌落形態(tài)、色澤、氣生菌絲的有無(wú)、產(chǎn)色素情況等特點(diǎn)，初步鑒定為放線菌[6-8]，并對(duì)分離到的放線菌菌落進(jìn)行編號(hào)。經(jīng)純化后的菌株于高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～14 d后于4℃保存。

1.2.2 拮抗放線菌的初篩 從斜面刮取放線菌孢子配成濃度為106個(gè)/mL的孢子懸浮液，吸取10 mL接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于28℃，150 r/min培養(yǎng)4 d。從斜面刮取番茄早疫病菌接種于PDA平板，于26℃培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)滿平板備用。

篩選拮抗放線菌時(shí)，用直徑7 mm的打孔器在長(zhǎng)滿番茄早疫病菌的PDA平板上打孔，將打下的菌餅接入待測(cè)的PDA平板中央；將放線菌發(fā)酵液過(guò)濾獲得無(wú)菌濾液，用滅菌的濾紙片（直徑7 mm）均勻地吸足發(fā)酵液后，以對(duì)角線的方式對(duì)稱(chēng)地放在菌餅四周[8]，26℃培養(yǎng)7 d后觀察抑菌效果，重復(fù)3次。以接種番茄早疫病菌但不放置放線菌發(fā)酵液紙片的平板為對(duì)照。

1.2.3 拮抗放線菌的復(fù)篩 將初篩得到的具有拮抗效果的放線菌，采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行復(fù)篩。在PDA平板中央接入番茄早疫病病菌菌餅，用滅菌的濾紙片（直徑7 mm）均勻地吸足發(fā)酵液后，以對(duì)角線的方式對(duì)稱(chēng)地放在菌餅四周[9]，放置時(shí)以3張濾紙片層疊，以保證吸有足夠的放線菌發(fā)酵液來(lái)抑制病原菌，26℃培養(yǎng)7 d后觀察抑菌效果，重復(fù)3次。以接種番茄早疫病菌但不放置放線菌發(fā)酵液紙片的平板為對(duì)照。

1.2.4 拮抗放線菌的形態(tài)觀察 采用插片法[10]培養(yǎng)待鑒定的拮抗菌株，在顯微鏡下觀察菌絲和孢子絲的形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌的分離與純化

從感染番茄早疫病的土壤樣品中經(jīng)過(guò)梯度稀釋分離后，根據(jù)菌落形態(tài)、大小、色澤等對(duì)具有不同生長(zhǎng)特征的菌落進(jìn)行編號(hào)，從平板上挑取菌落，分離純化后共得到放線菌32株。

2.2 拮抗放線菌的初篩和復(fù)篩

將番茄早疫病菌菌餅接入PDA平板中央，在其對(duì)角線等距離分別放入吸足32株放線菌發(fā)酵液的濾紙片。培養(yǎng)7 d后，初步篩出對(duì)番茄早疫病菌生長(zhǎng)有拮抗效果的放線菌8株。將這8株放線菌，采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行復(fù)篩，最終篩選出對(duì)番茄早疫病菌具有明顯拮抗效果的放線菌3株，編號(hào)分別為 Act-11，Act-13，Act-25。

從圖1可以看出，將番茄早疫病菌與拮抗菌在PDA平板上對(duì)峙培養(yǎng)7 d后，拮抗菌對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑菌帶，靠近拮抗菌邊緣處的病原菌不能正常向外擴(kuò)展，并且邊緣菌絲變得彎曲。另外，對(duì)番茄早疫病菌沒(méi)有拮抗效果的放線菌不影響病原菌菌絲的正常生長(zhǎng)，菌絲可繞過(guò)濾紙片向外擴(kuò)展生長(zhǎng)。

2.3 拮抗放線菌的形態(tài)觀察

在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，菌株Act-11氣生菌絲為淺粉紅色，基內(nèi)菌絲淺黃色，無(wú)可溶性色素產(chǎn)生；菌絲易斷裂，孢子絲螺旋。菌株Act-13氣生菌絲灰至灰褐色，基內(nèi)菌絲褐灰色至褐色，無(wú)可溶性色素產(chǎn)生；菌絲生長(zhǎng)良好，不斷裂，孢子絲螺旋。菌株Act-25氣生菌絲淡綠灰黃色至灰色，基內(nèi)菌絲黃褐色，無(wú)可溶性色素產(chǎn)生；孢子絲直或波曲（圖2）。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)對(duì)感病番茄土壤中的放線菌進(jìn)行分離篩選，獲得3株對(duì)番茄早疫病菌具有較好抑制作用的拮抗放線菌，且3株放線菌都是通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)物抑制病原菌的生長(zhǎng)。

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年的病蟲(chóng)害發(fā)生面積達(dá)2.0億～2.6億hm2，農(nóng)藥的用量達(dá)數(shù)10萬(wàn)t，且我國(guó)的農(nóng)藥結(jié)構(gòu)極不合理，基本上以化學(xué)農(nóng)藥占主導(dǎo)，其中，高毒、高殘留、對(duì)環(huán)境影響大的農(nóng)藥用量占1/2以上[11]，因此，開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥是減少化學(xué)農(nóng)藥用量的有效途徑之一，也符合發(fā)展綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)的要求。

我國(guó)已經(jīng)開(kāi)展關(guān)于番茄早疫病生物防治研究，但國(guó)內(nèi)用以防治番茄早疫病菌的生防菌或生防制劑均還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段或小試階段[12]。高芬等[13]從漚肥浸漬液中分離菌株來(lái)篩選對(duì)番茄早疫病菌有抑菌效果的拮抗菌，通過(guò)平皿對(duì)峙拮抗和液體培養(yǎng)篩選，結(jié)果篩選出6株抑菌效果較好的菌株。楊冬靜等[14]采用杯碟法測(cè)定表明，枯草芽孢桿菌NJ-18菌株對(duì)番茄早疫病菌的菌絲生長(zhǎng)有強(qiáng)烈拮抗作用；利用利福平抗性標(biāo)記證明NJ-18能夠在番茄根、莖、葉內(nèi)定殖；NJ-18發(fā)酵液噴施處理盆栽番茄苗后接種，14 d后對(duì)番茄早疫病的防治效果達(dá)72.9%，顯著高于50%異菌脲2 000倍液45.7%的防治效果。

本研究篩選出Act-11，Act-13和Act-25共3株放線菌對(duì)番茄早疫病有很強(qiáng)的抑菌活性，是較好的防治早疫病的有益微生物，從中開(kāi)發(fā)出新型、高效、無(wú)毒的天然農(nóng)用殺菌劑的潛力十分巨大，為番茄病害的生物防治提供可能，對(duì)實(shí)現(xiàn)番茄早疫病的安全、有效防治具有十分重要的意義。3株拮抗菌的獲得不僅為開(kāi)發(fā)出廉價(jià)、高效的生物農(nóng)藥奠定了菌種基礎(chǔ)，而且為進(jìn)一步研究番茄早疫病高效拮抗菌的拮抗機(jī)制提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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