李紅麗，詹麗娥，王彩先，唐 娟，陸冰洋

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的仔豬腸道傳染性疾病，常見的有仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病3種，以發(fā)生腸炎、腸毒血癥、敗血癥為特征[1-2]。仔豬感染大腸桿菌的發(fā)病率為26%～32%，病死率為20%左右，對養(yǎng)豬業(yè)為害極大。豬大腸桿菌有數(shù)百種血清型，已確定的菌體抗原（O）180種、表面莢膜抗原（K）104種和鞭毛抗原（H）60種。

2011—2012年，從山西省50多個規(guī)模化養(yǎng)豬場無菌采集疑似大腸桿菌病死仔豬心、肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)以及可疑病豬的直腸內(nèi)容物等病料，進(jìn)行大腸桿菌分離、血清型鑒定及耐藥性檢測[3]，旨在快速準(zhǔn)確地調(diào)查清楚存在于山西省豬致病性大腸桿菌的血清型及分布情況，以及根據(jù)臨床實際情況研發(fā)具有針對性的、目前流行血清型的豬大腸桿菌病的預(yù)防用多價高效滅活菌苗，篩選出敏感價廉的預(yù)防、治療用藥物，建立豬大腸桿菌病的綜合防治體系。

1 材料和方法

1.1 病料來源

對山西省50多個規(guī)?；B(yǎng)豬場疑似豬大腸桿菌病的病死豬進(jìn)行剖檢，無菌采集發(fā)病仔豬心、肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)以及可疑病豬的直腸內(nèi)容物等病料，進(jìn)行致病性大腸桿菌的分離。

1.2 試劑、儀器

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基粉購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，麥康凱培養(yǎng)基粉購自廣東環(huán)凱微生物科技公司，主要致病性大腸桿菌O抗原定型血清、藥敏試驗質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希氏菌（ATCC 25922）購自天津生物芯片技術(shù)有限公司，伊紅美蘭培養(yǎng)基粉、三糖鐵培養(yǎng)基粉、營養(yǎng)肉湯、微量生化反應(yīng)管、藥敏紙片購自杭州天和試劑公司。

1.3 試驗動物

試驗小白鼠 219只（體質(zhì)量（21.0±2.85）g）購自山西省醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)[4-6]

用滅菌棉拭子取黃、白痢病仔豬直腸內(nèi)容物或無菌采集死亡仔豬心、肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)等病料，接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18～24 h后，取可疑菌液劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24 h，取磚紅色單個菌落接種于伊紅美蘭培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h后，挑取紫黑色帶金屬光澤單個菌落接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫純化培養(yǎng)12～18 h后，將純化的細(xì)菌放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

對純化的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察細(xì)菌的形態(tài)及染色特征。取培養(yǎng)特性、形態(tài)和革蘭氏染色反應(yīng)均符合大腸桿菌特征的菌株接種在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24 h，之后將純化的細(xì)菌放4℃冰箱保存，做生化鑒定用。

1.6 生化試驗

取已分離純化的菌株用微量生化反應(yīng)管進(jìn)行生化反應(yīng)試驗。取待檢菌純培養(yǎng)物分別接種在乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、鳥氨酸、賴氨酸、尿素酶、枸櫞酸鹽、三糖鐵瓊脂、半固體瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。將待檢菌純培養(yǎng)物少量接種于葡萄糖蛋白胨水生化管中，37℃培養(yǎng)24～48 h后進(jìn)行甲基紅試驗、VP試驗和吲哚試驗。

1.7 致病性試驗[7-8]

將分離出符合大腸桿菌生化特征的72株細(xì)菌分別接種在72支營養(yǎng)肉湯試管中，37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，細(xì)菌計數(shù)后，將菌液稀釋成約1×1010cfu/mL。將219只健康的小白鼠隨機(jī)分為73組，每組3只，72組為試驗組，1組為對照組。試驗組腹腔接種菌液，每只0.3 mL；而對照組腹腔接種0.3 mL滅菌生理鹽水，隔離飼養(yǎng)。觀察小白鼠發(fā)病和致死情況，剖檢死亡小白鼠，取其臟器劃線接種在麥康凱培養(yǎng)基上，挑取磚紅色單個菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，對純化的細(xì)菌革蘭氏染色鏡檢觀察其形態(tài)并進(jìn)行生化試驗，各項檢測都符合大腸桿菌特征的菌株就判定為致病性大腸桿菌。

1.8 致病性豬大腸桿菌O抗原血清型鑒定[9-10]

將69株致病性大腸桿菌分別接種在69支營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，之后用2 mL 0.5%石炭酸生理鹽水洗下菌落，并用生理鹽水稀釋至約1×1010cfu/mL，將稀釋的菌液做好標(biāo)記于121℃高壓2 h后，將每一種菌液都作為抗原和各型O抗原血清進(jìn)行玻片凝集試驗以確定細(xì)菌的O血清型。先用微量滴管吸取1滴O抗原單因子血清于玻片上，再將等量的待檢菌液加于血清中，即刻將二者充分混勻，室溫下作用3～5 min，若出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng)，同時以菌懸液與生理鹽水混合物作陰性對照，以排除細(xì)菌自凝現(xiàn)象，玻片凝集試驗為陽性的，再進(jìn)行試管凝集試驗以確定其血清型。

1.9 藥敏試驗[11]

藥敏試驗參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）推薦的瓊脂紙片擴(kuò)散方法。購買的26種抗菌藥物紙片在使用前均按照CLSI瓊脂紙片擴(kuò)散法操作要求進(jìn)行質(zhì)控，測試各種藥物紙片對大腸桿菌（ATCC25922）質(zhì)控菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑是否在要求范圍之內(nèi)，符合要求者方可使用。對69株致病性大腸桿菌進(jìn)行耐藥性監(jiān)測，將致病性菌株營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物以滅菌生理鹽水稀釋至與0.5麥?zhǔn)蠁挝槐葷峁軡岫认喈?dāng)（約108cfu/mL），無菌吸取各致病菌液0.2 mL，接種于水解酪蛋白（MH）瓊脂培養(yǎng)平板上，用涂菌棒涂布均勻，蓋上平皿蓋靜置2～3 min，待菌液完全吸收后，用鑷子無菌操作將藥敏紙片貼到培養(yǎng)基的表面，把平板置于37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，判斷標(biāo)準(zhǔn)按照CLSI頒布的藥敏試驗紙片擴(kuò)散法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

分離出的77株病原菌在普通瓊脂上長出直徑為2～3 mm、圓形凸起的半透明淺灰色菌落；在麥康凱瓊脂平板上長出直徑為2～3 mm的圓形、磚紅色菌落；在伊紅美蘭瓊脂平板上長出紫黑色、帶金屬光澤的圓形菌落；在普通肉湯中呈均勻混濁，液面有菌膜，管底有黏性白色沉淀，振蕩呈云霧狀散開。

2.2 形態(tài)特征

革蘭氏染色后，鏡檢可見紫紅色、著色均勻、單個或成對的無莢膜、無芽孢、兩端鈍圓的短桿菌，77株病原菌都符合豬大腸桿菌形態(tài)特征。

2.3 生化試驗結(jié)果

分離菌株生化試驗結(jié)果顯示，有72株病原菌能發(fā)酵乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，對蔗糖多數(shù)不能發(fā)酵，只有極少數(shù)發(fā)酵產(chǎn)酸，尿素酶試驗陰性，不產(chǎn)生H2S，有鞭毛，能運(yùn)動。甲基紅試驗、吲哚試驗是陽性，VP試驗、枸櫞酸鹽利用試驗是陰性，符合豬大腸桿菌的生化特性，證實了這72株病原菌都是豬大腸桿菌。5株病原菌的三糖鐵培養(yǎng)基變成了黑色，有H2S產(chǎn)生，不符合豬大腸桿菌的生化特性。

2.4 致病性試驗結(jié)果

小白鼠接種12 h后，有69組試驗組小白鼠全部發(fā)病，大部分小白鼠出現(xiàn)精神沉郁、低頭昏睡、體溫升高、采食量大幅減少、拉稀、呼吸加快，106只小白鼠24 h內(nèi)死亡，101只小白鼠48 h內(nèi)死亡，剖檢死亡小白鼠可見腸道嚴(yán)重臌脹，腸腔內(nèi)充滿水樣稀便，有的腸黏膜有出血斑點。無菌采集試驗組小白鼠的心血、肝和脾劃線接種在麥康凱瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)20 h，有磚紅色菌落生長，挑取單個菌落接種在普通營養(yǎng)瓊脂斜面純培養(yǎng)后，革蘭氏染色鏡檢及生化鑒定表明，此菌與接種的細(xì)菌為同種細(xì)菌，說明該菌對小白鼠具有較強(qiáng)的致病力。有3組試驗組小白鼠接種12 h后，只表現(xiàn)精神沉郁，第2天就精神好了，和對照組小白鼠飼養(yǎng)7 d后全部存活，剖檢未見病變，結(jié)果證明有69株病原菌是致病性豬大腸桿菌。

2.5 豬致病性大腸桿菌O抗原血清型鑒定結(jié)果

用50種單因子O抗原血清對69株豬大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定，除2株未鑒定出血清型外，其余67株血清型分屬于30個血清型。其中，O138，O101，O9，O119，O141有 27株，占所鑒定分離菌株的40.3%，這幾種血清型均為山西省50多個規(guī)模化養(yǎng)豬場目前流行的優(yōu)勢血清型（表1）。

表1 致病性豬大腸桿菌O抗原血清型鑒定結(jié)果

2.6 藥物敏感性試驗結(jié)果

豬大腸桿菌對抗生素的敏感性試驗結(jié)果如表2所示。

表2 豬大腸桿菌對抗生素的敏感性試驗結(jié)果 %

由表2可知，本研究分離到的致病性大腸桿菌，除了對頭孢呋辛鈉、頭孢哌酮無耐藥菌株外，其余的24種試驗藥物都存在耐藥菌株，所有的致病菌株對青霉素、鏈霉素、磺胺嘧啶、利福平、痢菌凈、紅霉素這6種抗生素100%耐藥，對諾氟沙星、阿莫西林、氨芐青霉素、氯霉素、慶大霉素、強(qiáng)力霉素、羅紅霉素、環(huán)丙沙星藥物耐藥的菌株比例在65%以上；對菌株高度敏感的藥物有頭孢呋辛鈉、頭孢哌酮、頭孢噻肟、磷霉素，高敏菌株比例在87.0%以上。

69種致病菌株均表現(xiàn)出不同程度的多重耐藥，對26種受試抗菌藥物，最少的是6耐，有3株，占所有檢測菌株的4.3%，最高的是耐24種抗菌藥物，有2株（2.9%）。其中，耐15種抗菌藥物的菌株最多，有11株（15.9%）；其次為14耐和16耐，各7株（各占10.1%）；17～23耐的有18株（26.1%）（圖 1）。

3 討論與結(jié)論

在分離的69株致病性菌株中，有2株不能鑒定出血清型，鑒定出67株致病菌株中共有30種血清型。這說明致病性大腸桿菌的血清型有多樣化發(fā)展的趨勢，雖然流行的致病菌株的血清型比較多，但 O138，O101，O9，O119，O141這 5種血清型的菌株一共有27株，占所有能定型菌株的40.3%，是山西地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型。在對山西50多個養(yǎng)豬場致病性大腸桿菌血清型調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，同一個豬場暴發(fā)大腸桿菌病時，有時可分離出多種血清型的致病菌株，且在不同時期分離出的致病菌株血清型也不完全相同，總會有些改變。不同地域、不同豬場分離出的致病菌株血清型都會有差異。因此，在大腸桿菌的免疫預(yù)防中，國內(nèi)外雖然研制了各種類型的基因工程菌苗與多價滅活菌苗，但由于豬大腸桿菌致病菌血清型眾多，所用疫苗結(jié)果都不理想，所以，只有選擇適合該豬場流行血清型的大腸桿菌菌苗[12]，方能有效預(yù)防豬大腸桿菌病發(fā)生。建議規(guī)?；i場最好多次進(jìn)行致病性大腸桿菌分離、血清型鑒定，總結(jié)本豬場致病性大腸桿菌流行的血清型種類，以便有針對性用多價滅活菌苗進(jìn)行免疫，預(yù)防豬大腸桿菌病。

從藥敏試驗結(jié)果可以看出，分離的69株大腸桿菌對頭孢呋辛鈉、頭孢哌酮均敏感，且高敏比例達(dá)89%以上，因此，頭孢呋辛鈉、頭孢哌酮可作為山西地區(qū)防治豬大腸桿菌病的首選藥物，其余24種抗生素的耐藥菌株和高敏菌株均占一定比例，且全都為多重耐藥，表明山西地區(qū)大腸桿菌耐藥性普遍較高，耐藥性較高的多數(shù)是臨床上應(yīng)用較多和較久的抗菌藥。本研究發(fā)現(xiàn)，血清型相同但來自不同豬場的致病菌株有完全不同的耐藥譜，而來自同一豬場的不同血清型的致病菌株竟然有極其相似的耐藥譜，這可能與細(xì)菌的耐藥性通過質(zhì)粒介導(dǎo)在細(xì)菌間傳播和擴(kuò)散有關(guān)。山西地區(qū)豬大腸桿菌耐藥性高的主要原因是長期不合理使用抗菌藥物，在飼料中添加低劑量的抗生素以促進(jìn)動物生長、提高飼料利用率，在暴發(fā)大腸桿菌病時不進(jìn)行藥敏試驗，憑自己的主觀來判斷抗生素的療效，沒有科學(xué)依據(jù)頻繁更換治療藥物，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性產(chǎn)生。為了提高抗菌藥物的療效，用藥時要嚴(yán)格按照說明，運(yùn)用合理的劑量與療程。養(yǎng)殖場的技術(shù)人員要細(xì)心觀察豬群，對發(fā)病豬只要隔離飼養(yǎng)，分離出致病菌株進(jìn)行藥敏試驗，篩選出最敏感的抗菌藥物再進(jìn)行治療，且每次發(fā)病都要做好記錄，并對治療效果進(jìn)行評價，一旦豬場有大腸桿菌病暴發(fā)，可依據(jù)歷史記錄做出準(zhǔn)確的判斷，采取科學(xué)的治療方案，將損失降到最低。

長期以來，我們對豬大腸桿菌病的防治以藥物治療為主，也取得了一定的效果，但經(jīng)過藥物治療后的仔豬，雖然存活下來，但是生長緩慢，飼料轉(zhuǎn)化率低，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于致病性豬大腸桿菌對化學(xué)藥品極易產(chǎn)生耐藥性，加之基層飼養(yǎng)者在實際生產(chǎn)中長期盲目地混合用藥，造成病原菌的耐藥譜越來越廣泛，甚至到無藥可用的嚴(yán)峻地步，因此，對豬大腸桿菌病應(yīng)當(dāng)以預(yù)防為主。預(yù)防仔豬大腸桿菌病的關(guān)鍵在于消滅傳染源和保證仔豬從初乳中獲得足夠的被動免疫保護(hù)，要加強(qiáng)消毒措施，實行全進(jìn)全出制，對豬舍和外部環(huán)境進(jìn)行徹底消毒，保持豬舍通風(fēng)、溫暖、清潔、干燥，對預(yù)產(chǎn)母豬要進(jìn)行全身體表消毒，防止把體表攜帶的大腸桿菌傳染給仔豬。仔豬在出生后2～3周要依賴母源抗體的保護(hù)，因此，要確定本養(yǎng)殖場存在的致病性大腸桿菌的血清型，針對性的給懷孕后期母豬接種疫苗，可提高初乳中特異抗體的水平，以便仔豬獲得被動免疫，這對預(yù)防仔豬大腸桿菌病具有重要意義。

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