刁 波，劉 琴，王麗萍，張 宜

(中國(guó)人民解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，武漢 430070)

葉酸聯(lián)合成體神經(jīng)干細(xì)胞治療創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的實(shí)驗(yàn)

刁 波，劉 琴，王麗萍，張 宜

(中國(guó)人民解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，武漢 430070)

目的 觀(guān)察葉酸聯(lián)合成體神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的治療作用，探討其可能作用機(jī)制。方法 120只Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，正常組，模型組，假手術(shù)組，葉酸注射組，成體神經(jīng)干細(xì)胞移植組，成體神經(jīng)干細(xì)胞移植+葉酸注射組。倒置顯微鏡下觀(guān)察神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;流式細(xì)胞儀檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD105、CD45、CD44、CD29的表達(dá);免疫熒光法檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE成熟神經(jīng)元的特異性標(biāo)志)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物)的表達(dá);平衡木實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)與整和能力;Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力;HE染色及Brdu免疫組化實(shí)驗(yàn)觀(guān)察腦組織形態(tài)學(xué)變化;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)大鼠腦組中腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的表達(dá);蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)腦組織中凋亡相關(guān)蛋白BCL－2、Bax、Caspase－3的表達(dá)。結(jié)果 分離所得細(xì)胞能在體外傳代培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá) CD44、CD29，陰性表達(dá)CD105、CD45，細(xì)胞經(jīng)胎牛血清誘導(dǎo)分化后能形成NSE或GFAP陽(yáng)性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明，葉酸與成體神經(jīng)干細(xì)胞干預(yù)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型后能顯著改善其行為學(xué)變化，減輕腦組織的炎癥反應(yīng)，恢復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞，增加腦組織內(nèi)BDNF、NGF的含量，上調(diào)BCL－2的表達(dá)，下調(diào) Bax、Caspase－3的表達(dá)。結(jié)論 葉酸聯(lián)合成體神經(jīng)干細(xì)胞干預(yù)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠能顯著改善中樞神經(jīng)功能，對(duì)維持神經(jīng)元微環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。

葉酸;成體神經(jīng)干細(xì)胞;創(chuàng)傷性腦損傷

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是由創(chuàng)傷引起的腦組織損害，它是45歲以下人群死亡的主要原因。文獻(xiàn)報(bào)道［1］，在美國(guó)每年有200～800萬(wàn)人遭受TBI，約400～500萬(wàn)人因嚴(yán)重TBI而需住院治療，TBI的前3位原因是交通事故、槍傷和墜落，英國(guó)也是以交通事故為最常見(jiàn)病因［2］。成體神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是一類(lèi)具有多向分化潛能的細(xì)胞，能分化成神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞即神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，而且具有自我更新和維持的能力［3－4］。主要存在海馬齒狀回的顆粒下層(sub－granular zone，SGZ)、側(cè)腦室的室管膜下區(qū)(subvent ricular zone，SVZ)等部位［5－6］。葉酸(folate，p teroylglutamate或維生素B9)是保持身體健康、生長(zhǎng)及發(fā)育所必需的水溶性B族維生素，是一組由數(shù)目不同的谷氨酸殘?bào)w(glutamic－acid residues)的喋啶環(huán)結(jié)合而成的相關(guān)化學(xué)結(jié)構(gòu)物的總稱(chēng)。葉酸不但與造血系統(tǒng)有密切的關(guān)系，也參與了神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育。有學(xué)者研究表明，葉酸對(duì)NSCs的增殖、分化亦具有重要的影響［7－8］，但作用機(jī)制尚不明確。課題組通過(guò)前期工作發(fā)現(xiàn)葉酸能顯著降低缺氧條件下神經(jīng)細(xì)胞炎性蛋白的表達(dá)及 Ca2+超載的發(fā)生，明顯上調(diào)Notch1mRNA及Notch1蛋白的表達(dá)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)葉酸聯(lián)合成體神經(jīng)干細(xì)胞干預(yù)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠具有理論和技術(shù)上的可行性，為臨床采用葉酸合并成體NSC治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料Wistar大鼠由湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)［SCXK(鄂)2008－0004］，動(dòng)物使用合格證號(hào)［SYXK(鄂)2008－0007］。注射用亞葉酸鈣注射液購(gòu)置廣東嶺南制藥有限公司;DMEM/F12培養(yǎng)基、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (bFGF)、青鏈雙抗均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;N2、B27、胎牛血清(FCS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;NSE、GFAP抗體購(gòu)置美國(guó) Santa公司，山羊抗兔Cy3熒光二抗購(gòu)置美國(guó)KPL公司;CD105、CD45、CD44、CD29熒光抗體購(gòu)置 BD公司;BDNF、NGF ELASA 試劑盒購(gòu)置R＆D公司;Bcl－2、Bax、Caspase－3抗體購(gòu)置BioLegend公司。

1.2 成體NSC的分離、原代培養(yǎng)及傳代 取6周齡Wistar大鼠，戊巴比妥鈉過(guò)量麻醉致死，斷頭，無(wú)菌條件下取出腦組織，在Hanks平衡液內(nèi)分離SGZ和SVZ腦組織，收集于含 2mL神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM/F12 培養(yǎng)液添加 1%N2、2%B27、20μg/L EGF和20μg/L bFGF)的離心管。用1mL移液器反復(fù)吹打30次將大部分組織分離成細(xì)胞懸液，用75 μm濾網(wǎng)過(guò)濾除去未分離組織及細(xì)胞碎片。加培養(yǎng)液至細(xì)胞懸液達(dá)10mL并混勻，吸取10 μL細(xì)胞懸液與等量錐蟲(chóng)藍(lán)液混勻后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞總量。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液調(diào)節(jié)為 1×105個(gè)/mL后，置于 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3天半量換液，第2周吹打分離傳代。待第2代細(xì)胞形成神經(jīng)球后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 成體 NSC的鑒定［9］取擴(kuò)增一代的 NSC，去掉培養(yǎng)液，PBS洗2遍，用1∶1的0.25%的胰蛋白酶和0.2%EDTA混合液消化，用含20%BSA的PBS洗滌后制成濃度為1.0×106/mL的單細(xì)胞懸液，每個(gè)Eppendof管加500 μL細(xì)胞懸液，共3個(gè)檢測(cè)管。1號(hào)陰性對(duì)照(不加抗體)，2號(hào)管為同型對(duì)照(分別加入 5 μL 抗鼠的 IgG1－FITC、APC、PE、PerCP/Cy5.5)，3號(hào)管為檢測(cè)管(分別加入 5 μL抗人的CD105－PerCP/Cy5.5、CD45－APC、CD44－FITC、CD29－PE)。室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 成體NSC的誘導(dǎo)分化［10］待第2代細(xì)胞形成神經(jīng)球后，培養(yǎng)基中加入10%的FCS誘導(dǎo)成體NSC分化，在誘導(dǎo)的第7天，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS漂洗3次，用 5%BSA的封閉液(含0.2%Trition X－100)室溫封閉l h后，加入鼠來(lái)源的 GFAP及NSE抗體(1:100)，37℃作用2 h，PBS漂洗3次，每次5 min，加入 TRITC標(biāo)記的抗小鼠二抗1200)，避光37℃反應(yīng)1 h，PBS漂洗3次，每次5 min，接著用 DAPI染色，室溫5 min，PBS漂洗，熒光顯微鏡觀(guān)察拍照。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理120只SPF級(jí)8周齡雄性SD大鼠(200±10 g)，隨機(jī)分為6組，正常組、模型組、假手術(shù)組、干細(xì)胞移植組、注射葉酸組(0.5mg/d·kg)、干細(xì)胞移植+注射葉酸組。分別于神經(jīng)干細(xì)胞移植后第1天、14天、28天用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 腦外傷動(dòng)物模型的制作用Feeney法按自由落體致傷原理，自制撞擊裝置。撞桿頭端直徑 4.5mm，高2.5mm，保持90°垂直，于冠狀縫后1.5mm，中線(xiàn)右旁2.5mm處鉆一直徑為5mm的圓形骨窗，保持硬腦膜完整 ，將撞桿頭端置骨窗處，擊錘 (重40 g)沿外周導(dǎo)管從20cm高處自由落下沖擊撞桿導(dǎo)致腦部損傷，術(shù)后連續(xù)肌肉注射青霉素10萬(wàn)U 1周。假手術(shù)組大鼠僅切開(kāi)顱部皮膚，縫合。

1.7 成體NSC腦內(nèi)移植 動(dòng)物模型制備72 h后，將大鼠麻醉后固定于腦立體定向儀上，經(jīng)過(guò)無(wú)菌操作，用滅菌的玻璃微量進(jìn)樣器吸取 10ul成體 NSC細(xì)胞懸液(1×105個(gè)NSC)，在前囟后3mm和側(cè)1.1mm處分別在大腦皮層下2mm和4mm移植細(xì)胞，每點(diǎn)移植 5 uL細(xì)胞懸液，注射速度 1μL/min，注畢留針20 min并以0.5mm/min速度緩慢退針。退針后常規(guī)縫合，術(shù)后連續(xù)肌肉注射青霉素10萬(wàn)μL周。

1.8 平衡木實(shí)驗(yàn) 于神經(jīng)干細(xì)胞移植后1 d，14 d，28 d進(jìn)行。170cm長(zhǎng)，2cm寬的方木棒，平放在距地面70cm處，讓大鼠在平衡木上走。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分:穩(wěn)健地保持平衡;1分:完全抓住平衡木的一端;2分:抱住平衡木，一個(gè)肢體滑落;3分:抱住平衡木，兩個(gè)肢體滑落，或繞木旋轉(zhuǎn)≥60 s;4分:試圖保持平衡，但在40～60 s之間滑落;5分:試圖保持平衡，但在20～40 s之間滑落;6分:試圖保持平衡，但在20 s之內(nèi)滑落。平衡木試驗(yàn)是直接反映大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)與整和能力的指標(biāo)。

1.9 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)于神經(jīng)干細(xì)胞移植后14 d，28 d進(jìn)行。用 Morris水迷宮測(cè)試其學(xué)習(xí)與記憶成績(jī)。前4 d為訓(xùn)練時(shí)間，第5天為測(cè)試時(shí)間。訓(xùn)練每天上午進(jìn)行，訓(xùn)練5次，每次間隔15 min，每次將大鼠面向池壁分別從4個(gè)象限的4個(gè)入水點(diǎn)入水，記錄其在60 s內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期(escape latency)。如果達(dá)60 s仍未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其到達(dá)平臺(tái)，停留 30 s，本次成績(jī)計(jì)為 60 s，然后進(jìn)行下次訓(xùn)練。測(cè)試時(shí)取消平臺(tái)，同法觀(guān)察各組大鼠尋找隱蔽平臺(tái)所需的時(shí)間(潛伏期)。

1.10 HE染色及Brdu免疫組化 于神經(jīng)干細(xì)胞移植后1 d、14 d、28 d取腦組織行 HE染色及免疫組化染色。經(jīng)10% 水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)升主動(dòng)脈快速灌注肝素化0.9% 氯化鈉注射液150mL，繼之快速灌注冰冷的4%多聚甲醛液200mL，再用300mL在2 h內(nèi)慢速灌注，取腦組織浸入4%多聚甲醛內(nèi)4℃固定48 h，修成厚4mm塊，常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，作5μm冠狀切片，行 HE及 BrdU免疫組織化學(xué)染色。

1.11 免疫印跡法檢測(cè)腦組織中凋亡相關(guān)基因BCL－2、Bax、Caspase－3 的表達(dá) 將動(dòng)物快速斷頭取腦，分離全腦組織置于4℃預(yù)冷的全細(xì)胞裂解液0.6 ml冰水浴中勻漿，12 000 r/min 4℃離心5 min，取上清液。以考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合法蛋白定量，－80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?5 μg蛋白樣本加入2×SDS凝膠加樣緩沖液，煮沸 5 min，6 000 r/min離心 3 min，取上清液上樣，電泳后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后室溫下封閉2 h，將PVDF膜放入雜交袋，分別加入一抗(BCL－2、Bax、Caspase－3，1:800稀釋)4℃過(guò)夜，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1:1500稀釋)和預(yù)染蛋白Marker，室溫下振蕩孵育1 h，濾膜漂洗后加入顯影液顯色，放入X－光片夾中曝光。結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)掃描后，自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，在同一條件下測(cè)定目標(biāo)條帶整合光密度值，計(jì)算出各組樣品目標(biāo)條帶與內(nèi)參(βactin)的整合光密度比值。

1.12 ELISA法檢測(cè)腦內(nèi)BDNF和 NGF的含量 制備10%腦組織勻漿液，10000 rpm離心10 min，取上清測(cè)蛋白濃度，取50 uL待測(cè)樣品，采用 R＆D公司提供的BDNF和 NGF試劑盒，操作步驟嚴(yán)格遵循試劑盒所提供說(shuō)明書(shū)的要求。酶標(biāo)儀405 nm處測(cè)出各組A值，計(jì)算腦組中BDNF和 NGF的含量。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與分析 通過(guò)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件用單因素方差分析及t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示

2 結(jié)果(封底圖1、2、4)

2.1 成體NSC的形態(tài)學(xué)變化 倒置顯微鏡下，可見(jiàn)剛培養(yǎng)的細(xì)胞散在且胞體較小，呈圓形，折光性較好(圖1a)。3 d后逐漸形成由數(shù)個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞球(圖1b)。培養(yǎng)至5 d存活的細(xì)胞已形成由數(shù)十個(gè)到數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成的較大的細(xì)胞球(圖1c)。傳代后，在培養(yǎng)基中既可見(jiàn)到單細(xì)胞，也可見(jiàn)到呈不規(guī)則形狀的小細(xì)胞團(tuán)。傳代后部分單個(gè)細(xì)胞則出現(xiàn)分裂相，逐漸形成由較多細(xì)胞組成的細(xì)胞球。NSC經(jīng)10%FCS誘導(dǎo)分化后，1 d胞體出現(xiàn)突起，折光性較好(圖2a)。3 d鏡下觀(guān)察出現(xiàn)典型的神經(jīng)細(xì)胞(圖2b)。5 d神經(jīng)細(xì)胞胞體飽滿(mǎn)，周?chē)泄鈺?，軸、樹(shù)突細(xì)長(zhǎng)明顯，交織成網(wǎng)絡(luò)(圖2c)。

2.2 成體NSC的鑒定流式細(xì)胞儀檢測(cè)體外傳代培養(yǎng)第 1代的 NSCs表面標(biāo)記 CD105、CD45、CD44、CD29的表達(dá)，結(jié)果顯示，NSCs表面分子 CD44、CD29呈陽(yáng)性表達(dá)，不表達(dá) CD105，CD45，提示分離培養(yǎng)的細(xì)胞可能具有間充質(zhì)干細(xì)胞的性質(zhì)(圖3)。

圖3 流式細(xì)胞儀鑒定成體NSCs實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明原代培養(yǎng)所獲取的成體NSCs呈CD44、CD29雙陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為99.38%，但不表達(dá)CD105、CD45。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:所獲取的細(xì)胞具有明顯間充質(zhì)干細(xì)胞特征，符合實(shí)驗(yàn)要求Fig.3 The result ofFlow detection for adult NSCs The experimental results show that the primary culture of adult NSCs was acquired by CD44，CD29 positive expression，the rate was 99.38%，but did not express CD105，CD45.The experimental resultsindicate:the acquired cells with a distinct mesenchymal stem cell characteristics，in line with the experimental requirements

2.3 成體NSC的誘導(dǎo)分化 添加10%FCS培養(yǎng)基后，NSC很快貼壁分化，部分軸突相互交錯(cuò)連接。24 h后細(xì)胞表面發(fā)生突起，并隨著時(shí)間推移突起逐漸增多變長(zhǎng)，不同細(xì)胞的突起彼此相互交聯(lián)成網(wǎng)。7 d后進(jìn)行免疫熒光染色顯示，培養(yǎng)的細(xì)胞呈 GFAP或NSE免疫反應(yīng)陽(yáng)性，提示培養(yǎng)的細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元(圖4)。

2.4 平衡木實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表1可見(jiàn)，模型組大鼠平衡木評(píng)分在實(shí)驗(yàn)的各時(shí)間段均顯著高于正常組大鼠(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)提示，模型組大鼠經(jīng)創(chuàng)傷性損傷后其運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)與整和能力明顯下降。治療第1d，3組平衡木評(píng)分比較差異無(wú)顯著性意義(P ＞0.05);治療第14天，28天，NSCs移植組、注射葉酸組、聯(lián)合治療組平衡木評(píng)分較模型組均有顯著改善(P ＜0.05)，與NSCs移植組及葉酸注射組比較，聯(lián)合治療組能明顯改善平衡木評(píng)分。

表1 各組大鼠平衡木評(píng)分(n=4)Tab.1 Balance beam score of rats in different groups(n=4)

2.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與正常組比較，模型組在尋找隱蔽平臺(tái)所需時(shí)間均有延長(zhǎng)(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)提示，模型組大鼠經(jīng)創(chuàng)傷性損傷后其學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降。治療14 d，28 d，各治療組大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能均顯著改善，與NSCs移植組及葉酸注射組比較，聯(lián)合治療組能明顯改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能(表2)。

2.6 HE染色及Brdu免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 治療后第1天，模型組及注射葉酸組創(chuàng)傷灶及周?chē)[區(qū)可見(jiàn)較多細(xì)胞核固縮、深染、細(xì)胞膜完整的神經(jīng)細(xì)胞，即凋亡的神經(jīng)細(xì)胞，也可見(jiàn)許多呈空泡狀的細(xì)胞，為液化壞死的神經(jīng)細(xì)胞。NSCs移植組和聯(lián)合治療組均可見(jiàn)大量移植的細(xì)胞聚集、此時(shí)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)腫脹的細(xì)胞和炎性細(xì)胞。14 d時(shí)，聯(lián)合治療組大量細(xì)胞增生，主要為神經(jīng)元，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，但病灶周邊也可見(jiàn)周?chē)[區(qū)，其范圍較其他損傷組明顯縮小;NSCs移植組和注射葉酸組病灶區(qū)周?chē)[減輕，凋亡細(xì)胞減少，神經(jīng)元周?chē)梢?jiàn)有空隙，還可見(jiàn)胞核濃縮、深染，也有細(xì)胞增生，主要為膠質(zhì)細(xì)胞。28 d時(shí)，聯(lián)合治療組神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，幾乎未見(jiàn)明顯腫脹的細(xì)胞和炎性細(xì)胞，基本接近正常組織。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，移植局部室管膜周?chē)奂罅緽rdu陽(yáng)性細(xì)胞，提示移植的 NSCs能夠存活。隨時(shí)間延長(zhǎng)，移植的NSCs能沿一定路徑遷徙，最終大量分布在病灶部位。聯(lián)合治療組病灶部位亦聚集大量Brdu陽(yáng)性細(xì)胞，并且具有向神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)提示，葉酸可能會(huì)促進(jìn) NSCs的增殖，同時(shí)增強(qiáng)其神經(jīng)功能重建的作用，促進(jìn)受損腦組織修復(fù)，改善TBI大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。

表2 各組大鼠尋找隱蔽平臺(tái)所需的時(shí)間變化(s)(n=4)Tab.2 The change of time for finding hidden platform in different groups(n=4)

圖8 治療后第28天各組大鼠 BCL－2、Bax、Caspase－3及 Actin的免疫印跡實(shí)驗(yàn)電泳圖Fig.8 The result of Immunoblotting experiments for BCL－2、Bax、Caspase－3 and Actin protein after treatment of 28 days

2.7 凋亡相關(guān)蛋白 BCL－2、Bax、Caspase－3 的表達(dá)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了治療第28天時(shí)，各組大鼠腦組織中凋亡相關(guān)蛋白 BCL－2、Bax、Caspase－3 的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組均強(qiáng)表達(dá)內(nèi)參 Actin蛋白，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。28 d 時(shí)，BCL－2、Bax、Caspase－3在正常組均有表達(dá)。與模型組比較，NSCs移植組及注射葉酸組 BCL－2表達(dá)具有上升趨勢(shì)，Bax及 Caspase－3表達(dá)具有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。聯(lián)合治療組 BCL－2表達(dá)明顯上升，Bax及 Caspase－3表達(dá)顯著下降(P＜0.05)(圖8－9)。

2.8 BDNF和 NGF在腦組織中的含量 ELASA實(shí)驗(yàn)表明，模型組大鼠腦組中的BDNF和 NGF的含量明顯下降，營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)能力下降。補(bǔ)充一定量的NSCs和腹腔注射葉酸后，BDNF和 NGF的含量明顯上升，對(duì)恢復(fù)神經(jīng)生理功能具有顯著作用，聯(lián)合治療組二者含量上升明顯，顯著高于單一治療組(表3、表4)。

圖9 各組大鼠 BCL－2、Bax、Caspase－3的灰度比值 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組、模型組、假手術(shù)組、葉酸組、干細(xì)胞組及聯(lián)合治療組的 BCL－2灰度比值分別為 1.138、0.0892、0.665、0.525、0.685、0.883;Bax灰 度比值分別為 0.644、1.417、0.711、1.003、0.945、0.887;Caspase－3 灰 度 比 值 分 別 為0.232、0.735、0.445、0.559、0.401、0.322Fig.9 The intensity ratio of BCL－2，Bax，Caspase－3 in each group The experimental results show that，the normal group，model group，sham operation group，folic acid group，stem cell group and combined treatment group BCL－2intensity ratios were 1.138，0.0892，0.665，0.525，0.685，0.883;Bax grayness ratio were 0.644，1.417，0.711，1.003，0.945，0.887;Caspase－3 intensity ratios were 0.232，0.735，0.445，0.559，0.401，0.322

表3 各組大鼠腦組織中BDNF的含量變化(ng/gpr)(n=4)Tab.3 The change of BDNF content in brain tissue in different groups(ng/gpr)(n=4)

表4 各組大鼠腦組織中NGF的含量變化(ng/gpr)(n=4)Tab.4 The change of NGF content in brain tissue in different groups(ng/gpr)(n=4)

3 討論

腦外傷后由于血腦屏障破壞、神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常、炎性介質(zhì)積聚和腦微循環(huán)障礙導(dǎo)致腦功能缺失［11－12］。既往治療多側(cè)重于從一個(gè)或多個(gè)方面阻斷病變進(jìn)展。胚胎發(fā)生學(xué)的研究提示任何神經(jīng)細(xì)胞群的建立和功能維持均依賴(lài)于細(xì)胞內(nèi)外多種特異性信號(hào)的相互作用，這些信號(hào)包括多種生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)細(xì)胞之間的突觸聯(lián)系［13－14］。因此，改變腦局部微環(huán)境，增加神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)和修復(fù)因子成為治療研究方向。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞沒(méi)有再生能力，損傷后死亡的細(xì)胞不能像上皮組織那樣由再生的細(xì)胞替補(bǔ)。但是，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也存在有干細(xì)胞，即成體 NSC。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)［15－16］，NSC 不光存在于胚胎期的腦組織中，在發(fā)育成熟的腦部(包括人腦)也有NSC存在，其主要在前腦的室管膜下區(qū)(subvent ricular zone，SVZ)和海馬齒狀回的顆粒細(xì)胞下層(subgranular zone，SGZ)。我們從成年大鼠腦組織中分離NSCs并在體外進(jìn)行增殖培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀鑒定發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞表面分子CD29、CD44表達(dá)陽(yáng)性，CD45、CD105表達(dá)陰性，提示原代培養(yǎng)的NSCs的具有間充質(zhì)干細(xì)胞性質(zhì)。用第2代成體 NSCs經(jīng)10%FCS誘導(dǎo)，隨共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞能分化為表達(dá)GFAP和 NSE的細(xì)胞，提示所培養(yǎng)細(xì)胞為NSCs。但在正常情況下，這些成體 NSC大部分處于休眠狀態(tài)，基本沒(méi)有分裂和分化現(xiàn)象。在損傷和局部環(huán)境變化時(shí)，成體NSC的生理活性則會(huì)上升。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，腦內(nèi)單純移植成體 NSCs，行為學(xué)測(cè)試及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子檢測(cè)均表明移植14d后，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯改進(jìn)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡趨勢(shì)下降，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌量顯著上升，促進(jìn)神經(jīng)環(huán)路重建，促進(jìn)TBI大鼠神經(jīng)生理功能的恢復(fù)。

葉酸在體內(nèi)經(jīng)葉酸還原酶的作用，還原為具有活性的四氫葉酸，它主要是作為一碳單位的傳遞體，參與嘌呤和嘧啶的合成及氨基酸之間的相互轉(zhuǎn)化［17－18］，體內(nèi)葉酸缺乏則一碳單位傳遞受阻，核酸合成及氨基酸代謝受影響，而核酸及蛋白質(zhì)合成正是細(xì)胞增殖、組織生長(zhǎng)和機(jī)體發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此葉酸對(duì)調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化起到重要作用［19－20］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明治療 14 d后，葉酸能明顯改善TBI大鼠的平衡木評(píng)分和學(xué)習(xí)記憶能力，上調(diào) BCL－2基因的表達(dá)，下調(diào) Bax及 Caspase－3的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)腦內(nèi) BDNF和NGF的表達(dá)，營(yíng)養(yǎng)病灶周?chē)纳窠?jīng)細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，單純移植成體NSCs的生物學(xué)作用有好于單純注射葉酸作用的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，葉酸可能是通過(guò)動(dòng)員自身的成體NSCs增殖分化而達(dá)到改善其病情的作用。當(dāng)移植成體 NSCs和注射葉酸聯(lián)合治療 TBI大鼠時(shí)。14 d后，各檢測(cè)指標(biāo)均顯著好于模型組大鼠指標(biāo)(P＜0.01)，大鼠行為學(xué)表現(xiàn)恢復(fù)明顯;與單純成體NSCs移植組和葉酸注射組比較，聯(lián)合治療組亦明顯優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)提示，成體NSCs與葉酸聯(lián)合使用具有良好的協(xié)同作用，體外補(bǔ)充的葉酸不僅能動(dòng)員自身成體NSCs的增殖分化、同樣對(duì)移植的異源性成體NSCs增殖具有促進(jìn)作用。因此，葉酸聯(lián)合成體NSCs移植對(duì)TBI大鼠有明顯的治療作用，對(duì)TBI患者的臨床康復(fù)具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

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Study on Folic Acid Combined with Adult Neural Stem Cells in the Treatment of Traumatic Brain Injury in Rats

DIAO Bo，LIU Qin，WANG Li－ping，ZHANG Yi
(Department of Medical Experiment，Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command of Chinese PLA，Wuhan 430070，China)

Objective To explore the folic acid and adult neural stem cells’joint influencing mechanism on the rat with Traumatic Brain Injury，and to find out its possible mechanism.Methods Divide 120 rats to 6 groups randomly—normal group，mode group，sham operation group，folacin injection group，adult stem cells transplant group，and folacin injection plus adult stem cells transplant group.Observe the morphological change under the microscope，then，do flow cytometry test and detect the expression of the neural stem cells’facial notation—CD105、CD45、CD44、CD29.Examine the expression of neuron special enolase(NSE)and the expression of gelatinous fibre acidic protein(GFAP)withimmunofluorescence.Examine the rats’ability to motor－coordinate and conform with balance beam.Test each group’s learning and memorizing ability by conducting the Morris water maze experiment.Then，conduct the HE chromosome and Brdu immunohistochemistry experiment to detect morphological change of the brain tissue.After this，do the enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)to detect the expression of brain－derived neurotrophic factor(BDNF)and the expression of nerve growth factor.The last but not least，use western blotting to examine the expression of related dead protein in the brain tissue:BCL－2、Bax、Caspase－3.Results The separated cells can be vitro subcultured，by doing flow cytometry test，we find that positive cells express CD44 and CD29 while negative express CD105，CD45.Cells induced by fet al bovine serum can produce NSE or GFAP positive cells.Experiments suggest that traumatic brain injured rats can significantly improve their behavior after jointly influenced by the folic acid and adult neural stem cells.Besides，they can also reduce brain tissue inflammation，restore damaged nerve cells，increase brain tissue of BDNF and NGF＇s content，increase BCL 2 expression，and lower the expression of Bax，caspase－3.Conclusion The folic acid combined with adult neural stem cell intervention in traumatic brain injury in rats can significantly improve the central nervous system dysfunction，plays an important role to maintain the steady microenvironment in the neuron.

Folic acid;Adult neural stem cells;Traumatic brain injury

R322.8

A

1671－7856(2012)07－0048－08

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.007.013

2012－07－06

圖1 成體NSC的形態(tài)學(xué)變化
Fig.1 Morphological changes of adult NSC

圖2 成體NSC誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)變化
Fig.2 Morphological changes of adult NSC after induced

圖4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，成體NSCs經(jīng)10%胎牛血清誘導(dǎo)7d后，能分化為表達(dá)GFAP或NSE分子的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)提示所獲取的細(xì)胞為成體NSCs
Fig.4 Immunofluorescence experiments shoW that， as of NSCs With 10% fet al bovine serum7d after induction， can differentiate for the expression of the GFAP or NSE molecules in glial cells and nerve cells， the experiment suggested the acquired cells into NSCs

湖北省自然科學(xué)基金(2010CDZ030)。

刁波，男(1984－)，碩士，主管技師，研究方向:神經(jīng)生物學(xué)。E－mail:dpitao@163.com。

張宜，E－mail:hbpizy@tom.com。