張利軍，史慧勤，苑曉燕，余壽忠，趙 君，彭雙清

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究中心，北京 100071)

1-苯基-2-硫脲對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育與黑色素生成的影響

張利軍，史慧勤，苑曉燕，余壽忠，趙 君，彭雙清

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究中心，北京 100071)

目的 1-苯基-2-硫脲(PTU)可抑制斑馬魚(yú)胚胎黑色素的產(chǎn)生，保持斑馬魚(yú)透明，便于形態(tài)觀察和信號(hào)檢測(cè)。本文研究了PTU對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的影響和抑制斑馬魚(yú)胚胎黑色素生成，保持斑馬魚(yú)透明性的最佳濃度。方法 用不同濃度PTU處理23 hpf(受精后，hours post fertilization，hpf)斑馬魚(yú)胚胎，作用57 h后觀察80 hpf斑馬魚(yú)的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)改變，計(jì)算死亡率和孵化率，測(cè)量心率和靜脈竇-動(dòng)脈球之間的距離。結(jié)果 濃度為0.197mmol/L、0.296mmol/L PTU可以有效抑制黑色素生成，保持斑馬魚(yú)整體透明，對(duì)斑馬魚(yú)心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和生理功能無(wú)影響，且不影響斑馬魚(yú)正常孵化過(guò)程。隨著PTU濃度的增加，斑馬魚(yú)死亡率增加，孵化率下降，出現(xiàn)心包水腫，心臟畸形等改變，心率下降，靜脈竇-動(dòng)脈球之間的距離增大。結(jié)論 濃度不高于0.296mmol/L的PTU溶液能有效抑制斑馬魚(yú)黑色素生成，對(duì)斑馬魚(yú)心血管毒性研究無(wú)影響。

1-苯基-2-硫脲;斑馬魚(yú);心率;孵化率

斑馬魚(yú)(Danio rerio)作為一種新型脊椎模式生物已被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)研究。斑馬魚(yú)易飼養(yǎng)，繁殖能力強(qiáng)，斑馬魚(yú)胚胎透明，生長(zhǎng)發(fā)育快，施藥方式簡(jiǎn)單［1］。斑馬魚(yú)胚胎在發(fā)育早期，即使心血管系統(tǒng)有缺陷，也可以依靠溶解氧繼續(xù)發(fā)育。目前，斑馬魚(yú)已成為OECD和ISO毒性試驗(yàn)的推薦測(cè)試物種［2-4］。斑馬魚(yú)胚胎透明，發(fā)育到24 h左右則開(kāi)始出現(xiàn)黑色素，黑色素細(xì)胞會(huì)影響基因表達(dá)信號(hào)、綠色熒光蛋白信號(hào)、整體原位雜交信號(hào)檢測(cè)。因此，需要對(duì)斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行處理，抑制黑色素生成，保持其透明性。研究表明在斑馬魚(yú)原腸胚期(5.5 hpf)后使用PTU溶液代替養(yǎng)魚(yú)用水，能有效抑制黑色素生成，保持斑馬魚(yú)透明性，但PTU也具有毒性作用，高濃度PTU可影響斑馬魚(yú)孵化率，甚至產(chǎn)生致畸和致死效應(yīng)［5］。本文研究不同濃度 PTU對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的影響，為運(yùn)用斑馬魚(yú)進(jìn)行心血管毒性評(píng)價(jià)研究時(shí)選擇合適濃度PTU提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚(yú)為AB系斑馬魚(yú)，由北京大學(xué)生命科學(xué)院惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室繁殖。斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖和繁殖參照標(biāo)準(zhǔn)的方法［6］。雌雄斑馬魚(yú)成魚(yú)分開(kāi)飼養(yǎng)于愛(ài)生斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)中。水溫保持在28.5±1℃，鹽度為 450～500 mS/cm2，pH 為 7.5～8.5，光照周期為照明14 h/黑暗10 h交替進(jìn)行，每日喂2次活豐年蝦。采卵時(shí)，首日傍晚按雌雄1∶1的比例將健康斑馬魚(yú)成魚(yú)放入交配缸內(nèi)，次日清晨獲得受精卵。對(duì)受精卵進(jìn)行清洗后，移入斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)用水(60 mg/mL海鹽)中，28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 受試藥物

1-苯基-2-硫脲(PTU)購(gòu)自 sigma公司。將 PTU粉末溶于 0.3× Danieau(17mmol/L NaCl，2mmol/L KCl，0.12mmol/L MgSO4，1.8mmol/L Ca(NO3)2，1.5mmol/L HEPS，pH7.6)培養(yǎng)液中，配制成0.197mmol/L、0.296 mmol/L、0.742 mmol/L、1.48mmol/L、2.96mmol/L、7.39mmol/L 濃度的 PTU 試驗(yàn)液。

1.3 處理胚胎方法

在Olympus SZX10型體視顯微鏡下選擇發(fā)育至23 hpf(28體節(jié)期)的野生型AB系斑馬魚(yú)胚胎，按照隨機(jī)分配原則，每濃度30枚胚胎，加入相應(yīng)濃度PTU。對(duì)照組為胚胎培養(yǎng)用水。隨后加蓋封閉，置于28.5℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，讓胚胎繼續(xù)發(fā)育。待斑馬魚(yú)發(fā)育至80 hpf進(jìn)行觀察、拍照。此刻，未暴露斑馬魚(yú)胚胎已都孵化成幼魚(yú)［7］。試驗(yàn)過(guò)程中，每24 h更換1次PTU溶液。

1.4 死亡率與孵化率計(jì)算

每天觀察1次斑馬魚(yú)胚胎死亡、存活情況，并詳細(xì)記錄，將死亡胚胎和幼魚(yú)移去。斑馬魚(yú)發(fā)育至80 hpf，計(jì)算累積死亡率百分率，可根據(jù)艾博特(Abbott's)公式用對(duì)照組的死亡率進(jìn)行校正［8］:

P=100－ ［(C-P')/C×100］

P——已校正的存活百分率，%;

P'——試驗(yàn)濃度組中所觀察到的存活百分率，%;

C——對(duì)照組中的存活百分率，%。

斑馬魚(yú)胚胎從48 h開(kāi)始孵化，胚胎軀體全部(從頭到尾)從絨毛膜內(nèi)出來(lái)，認(rèn)為斑馬魚(yú)由胚胎孵化為幼魚(yú)。斑馬魚(yú)發(fā)育到80 hpf，基本全部孵化［9］。因此，我們從48 hpf定時(shí)觀察孵化情況，80 hpf統(tǒng)計(jì)各組斑馬魚(yú)孵化率。

1.5 形態(tài)觀察

Olympus SZX10型體視顯微鏡下每日觀察PTU對(duì)斑馬魚(yú)的影響，觀察的毒性終點(diǎn)包括:心包和卵黃囊水腫、出血、畸形等。

1.6 心率測(cè)量

斑馬魚(yú)發(fā)育至80 hpf，從各處理組和對(duì)照組隨機(jī)選擇5條斑馬魚(yú)，在用顯微攝像系統(tǒng)(340M-00-GE，DVC Co.，USA)對(duì)斑馬魚(yú)心跳攝像 30 s。使用Image J軟件對(duì)斑馬魚(yú)心跳錄像進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)心率［10］。

1.7 靜脈竇(sinus venous)與動(dòng)脈球(bulbus arteriosus)距離測(cè)量

斑馬魚(yú)心臟發(fā)育基本在最初2 d完成。30 hpf形成心室和心房，36 hpf心臟發(fā)生向右環(huán)化［11］，使得心房、心室在側(cè)面觀上部分重疊，心室在心房的右前側(cè)。心臟發(fā)育過(guò)程受到影響，心房和心室的位置將發(fā)生改變，靜脈竇(血液進(jìn)入斑馬魚(yú)心臟的部位)和動(dòng)脈球(血液流出斑馬魚(yú)心臟的部位)之間的距離相應(yīng)發(fā)生改變，兩者之間的距離是評(píng)價(jià)心臟環(huán)化程度的指標(biāo)，通過(guò)測(cè)量靜脈竇與動(dòng)脈球之間的距離可量化評(píng)價(jià)藥物對(duì)斑馬魚(yú)心臟影響程度［12］。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 PTU對(duì)斑馬魚(yú)死亡率的影響

斑馬魚(yú)發(fā)育至80 hpf，統(tǒng)計(jì)胚胎和幼魚(yú)死亡數(shù)，結(jié)果如表1所示，對(duì)照組斑馬魚(yú)發(fā)育正常，無(wú)胚胎和幼魚(yú)死亡，死亡率為0。2.96mmol/L PTU實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)出現(xiàn)死亡，死亡率為40.0±8.82%。7.39mmol/L PTU實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)全部死亡，死亡率達(dá)到100%。

表1 PTU對(duì)斑馬魚(yú)胚胎死亡率的影響Tab.1 Mortality of PTU on zebrafish embryos

2.2 PTU對(duì)斑馬魚(yú)孵化率的影響

結(jié)果如表2所示，斑馬魚(yú)發(fā)育至80 hpf，對(duì)照組斑馬魚(yú)胚胎已全部孵化成幼魚(yú)。PTU可抑制斑馬魚(yú)孵化，隨著PTU濃度的增加，孵化率逐漸下降，0.197mmol/L、0.296mmol/L PTU組斑馬魚(yú)胚胎全部孵化，0.742mmol/L組孵化率為 17.78±5.09%，1.48mmol/L PTU組斑馬魚(yú)胚胎孵化率為8.89±1.92%。2.96mmol/L PTU組斑馬魚(yú)無(wú)孵化，孵化率為0。

表2 PTU對(duì)斑馬魚(yú)孵化率的影響Tab.2 Hatching rates of PTU on zebrafish embryos

2.3 PTU對(duì)斑馬魚(yú)形態(tài)影響

結(jié)果如圖1所示，斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至80 hpf，對(duì)照組斑馬魚(yú)胚胎孵化成幼魚(yú)，形態(tài)正常，心血管系統(tǒng)等無(wú)畸形，有黑色素沉著。PTU實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)透明，無(wú)黑色素。0.197mmol/L、0.296mmol/L PTU實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)胚胎孵化成幼魚(yú)，形態(tài)正常，心血管系統(tǒng)等無(wú)形態(tài)學(xué)改變，無(wú)黑色素沉著。0.742mmol/L PTU實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚(yú)胚胎孵化延遲，1.48mmol/L、2.96mmol/L PTU實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)出現(xiàn)心包水腫，心臟畸形等形態(tài)學(xué)改變，畸形程度隨著濃度的增加而嚴(yán)重。7.39mmol/L PTU實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)胚胎無(wú)孵化，全部死亡。

圖1 不同濃度PTU處理后，80 hpf斑馬魚(yú)發(fā)育情況Fig.1 Normal and abnormal development of zebrafish embryos to PTU for different exposure concentration at 80hpf

2.4 PTU對(duì)斑馬魚(yú)心率影響

PTU作用57 h后，測(cè)量80 hpf斑馬魚(yú)心率。結(jié)果如圖2所示，PTU實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)心率下降。與對(duì)照組相比較，0.197mmol/L，0.296mmol/L PTU實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)心率和對(duì)照組斑馬魚(yú)心率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.742mmol/L，1.48mmol/L，2.96mmol/L PTU 實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)心率與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著PTU濃度增加而逐漸降低，呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。而7.39mmol/L PTU實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)全部死亡，無(wú)心率數(shù)據(jù)。

圖2 PTU對(duì)80hpf斑馬魚(yú)心率的影響Fig.2 PTU effects on heart rate of zebrafish embryos at 80hpf

2.5 PTU對(duì)斑馬魚(yú)SV-BA距離的影響

PTU可影響斑馬魚(yú)心臟發(fā)育，造成斑馬魚(yú)心臟環(huán)化不全，SV-BA之間的距離發(fā)生改變。結(jié)果如圖3所示，1.48mmol/L、2.96mmol/LPTU處理組斑馬魚(yú)SV-BA距離比對(duì)照組斑馬魚(yú)SV-BA間距增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 80 hpf斑馬魚(yú)靜脈竇(SV)與動(dòng)脈球(BA)之間的距離Fig.3 Distance between the sinus venosus(SV)and bulbus arterious(BA)in 80hpf zebrafish embryos

3 討論

斑馬魚(yú)在發(fā)育初期通體透明，發(fā)育過(guò)程中逐漸出現(xiàn)色素。斑馬魚(yú)有3種色素細(xì)胞:黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、虹色素細(xì)胞［13］。斑馬魚(yú)發(fā)育至 24 hpf，黑色素開(kāi)始從視網(wǎng)膜上皮生成，幾小時(shí)內(nèi)黑色素細(xì)胞迅速布滿(mǎn)胚胎。黑色素細(xì)胞的形成會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集和結(jié)果的判斷產(chǎn)生干擾。為排除黑色素的影響，保證科學(xué)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要保持斑馬魚(yú)胚胎透明。目前，最常用的方法是在試驗(yàn)過(guò)程中，加入PTU抑制黑色素的生成。PTU的作用原理是降低酪氨酸羥化酶活性，抑制酪氨酸向黑色素的轉(zhuǎn)換，從而阻斷黑色素合成途徑［14］。本研究結(jié)果表明，從23 hpf(28體節(jié)期)添加0.197mmol/L～0.296mmol/L PTU能有效抑制發(fā)育至80 hpf斑馬魚(yú)黑色素形成，保持斑馬魚(yú)透明性。

對(duì)于毒理學(xué)試驗(yàn)而言，毒性終點(diǎn)的選擇至關(guān)重要。生理功能的改變要早于形態(tài)學(xué)的改變，是最合適和最敏感的評(píng)價(jià)指標(biāo)［15］。研究發(fā)現(xiàn)心率是評(píng)價(jià)心臟功能最靈敏的指標(biāo)。斑馬魚(yú)心臟在22 hpf開(kāi)始跳動(dòng)，起初是一種蠕動(dòng)波。36 hpf心房和心室協(xié)調(diào)收縮。48 hpf功能性瓣膜開(kāi)始形成。本研究結(jié)果表明0.197mmol/L、0.296mmol/L PTU對(duì)斑馬魚(yú)心率不產(chǎn)生影響。0.742mmol/L、1.48mmol/L、2.96mmol/L PTU影響斑馬魚(yú)心臟功能，顯著性減低斑馬魚(yú)心率，呈現(xiàn)劑量－反應(yīng)關(guān)系。

孵化是斑馬魚(yú)生命過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，但不是個(gè)體發(fā)育點(diǎn)，不屬于斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的一個(gè)具體階段。孵化是一個(gè)生化和行為相結(jié)合的過(guò)程。首先，孵化島合成消化絨毛膜的酶，這些酶是高絨毛膜裂解酶(HCE)和低絨毛膜裂解酶(LCE);然后這些酶裂解絨毛膜，斑馬魚(yú)胚胎軀體扭曲撕開(kāi)絨毛膜，脫去絨毛膜，完成孵化過(guò)程，成為幼魚(yú)。因此，化合物對(duì)這兩環(huán)節(jié)中任一環(huán)節(jié)產(chǎn)生毒性作用都將影響其孵化，降低孵化率和延遲孵化［9］。孵化率是評(píng)價(jià)化合物對(duì)斑馬魚(yú)是否產(chǎn)生毒性作用的一個(gè)敏感指標(biāo)。我們發(fā)現(xiàn)濃度高于0.742mmol/L的PTU可對(duì)斑馬魚(yú)胚胎產(chǎn)生毒性作用，降低其孵化率。

高濃度的PTU不僅影響斑馬魚(yú)心臟功能，還影響斑馬魚(yú)心臟發(fā)育過(guò)程，產(chǎn)生器質(zhì)性損害，引起心包水腫等畸形，心臟環(huán)化不全，表現(xiàn)為SV與BA之間的距離明顯增長(zhǎng)。我們研究發(fā)現(xiàn)0.197mmol/L、0.296mmol/L PTU對(duì)斑馬魚(yú)心臟形態(tài)和功能不產(chǎn)生任何影響，不影響斑馬魚(yú)胚胎心臟發(fā)育過(guò)程和孵化過(guò)程，能很好抑制斑馬魚(yú)黑色素生成，保持斑馬魚(yú)透明性。Karlsson等［5］報(bào)道75mmol/L PTU可抑制黑色素生成，且對(duì)斑馬魚(yú)胚胎結(jié)構(gòu)和孵化率無(wú)影響，但該濃度并未被其他研究人員接受。可能是該濃度只能完全抑制36 h前斑馬魚(yú)黑色素生成，并不能完全抑制36 h后斑馬魚(yú)黑色素生成［16］。我們從斑馬魚(yú)心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能兩方面研究PTU的心血管毒性作用，發(fā)現(xiàn)使用的PTU濃度雖然比文獻(xiàn)報(bào)道的濃度要高，但對(duì)斑馬魚(yú)的結(jié)構(gòu)和生理功能沒(méi)有影響，且能有效保持發(fā)育至80 hpf斑馬魚(yú)胚胎的透明性。所以，我們認(rèn)為在斑馬魚(yú)心血管毒性試驗(yàn)中可以選擇低于0.296mmol/L濃度的PTU抑制斑馬魚(yú)黑色素的生成，且對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生影響。因此，在保證PTU對(duì)斑馬魚(yú)心血管系統(tǒng)無(wú)毒性影響的前提下，可以選擇合適的PTU濃度，以保證抑制黑色素生成的效果。

致謝:感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)研究所張靖溥老師提供DVC顯微攝像系統(tǒng)。

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Developmental and Melanogenesis Effects of 1-phenyl 2-thiourea(PTU)in Zebrafish Embryos

ZHANG Li-jun，SHI Hui-qin，YUAN Xiao-yan，YU Shou-zhong，ZHAO Jun，PENG Shuang-qing
(Research and Evaluation Center for Toxicology，Institute of Disease Control and Prevention，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China)

Objective To generate transparent zebrafish，embryos may be treated with 1－phenyl 2－thiourea(PTU)to inhibit melanogenesis during embryogenesis.When working with techniques designed to study gene expression during embryogenesis，especially in teleosts，signal detection may be aggravated by pigmentation.Here we focus on the effects of PTU on embryo，and describes an optimized protocol for generating transparent zebrafish using PTU.Methods zebrafish embryos at the stage of 23 hpf(hours post fertilization)were treated with serial concentrations of PTU.Morphological and physiological endpoints were selected and quantified for unexposed and exposed embryos.Mortality，heart rate，hatching rate and SV-BA distance were detected until 80 hpf.Results Exposure to 0.197mmol/L and 0.296mmol/L PTU completely inhibited pigmentation while avoiding problems with embryo mortality，teratogenesis，reduced hatching frequency，and heart rate.The highest PTU concentration resulted in reduced hatching frequency and embryo mortality.We observed pericardial and yolk sac edema.Conclusion Optimized conditions can achieve complete inhibition of pigmentation for generating transparent zebrafish while avoiding toxic effects of PTU treatment.

1-phenyl-2-thiourea(PTU);Zebrafish;Heart rate;Hatching rate

R965.1 R332

A

1671-7856(2012)09-0021-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.005

2012-08-25

國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2009ZX09501-034);國(guó)家973計(jì)劃(2011CB503803)。

張利軍，男，博士生，研究方向:藥物安全性評(píng)價(jià)。

彭雙清，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向:藥物安全性評(píng)價(jià);Email:pengsq@hotmail.com。