薛 慧，張國治，呂飛杰，臺建祥，呂小文

(1.河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450052；2.中國農業(yè)科學院 作物科學研究所，北京 100081; 3.中國農業(yè)科學院 飼料研究所,北京 100081)

抗性淀粉測定方法的研究

薛 慧1，2，張國治1，呂飛杰2*，臺建祥2，呂小文3

(1.河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450052；2.中國農業(yè)科學院 作物科學研究所，北京 100081; 3.中國農業(yè)科學院 飼料研究所,北京 100081)

抗性淀粉的測定方法有Berry法、Englys法、Bjorck法、Champ法、Goni法等.以木薯抗性淀粉和抗性淀粉標準品為原料，通過對抗性淀粉的處理方法（AOAC法、Goni法）以及還原糖的測定方法（3,5-二硝基水楊酸法、D-葡萄糖法）進行對比，得到木薯抗性淀粉最適合的測定方法.同時也研究了樣品多少對測定結果的影響.結果表明，AOAC-GOPOD法操作簡單、準確性高、重復性好，酶用量充足，是測定木薯抗性淀粉的首選方法.

木薯；抗性淀粉；測定方法

0 引言

抗性淀粉（resistant starch）是指在小腸內不能消化，但在大腸內可以發(fā)酵的淀粉.抗性淀粉是一種不溶性的膳食纖維，但它與可溶性的膳食纖維性質相近，如瓜爾膠［1］.研究表明：抗性淀粉可以降低甘油三酯和膽固醇的濃度，改善腸道菌群，預防直腸癌和腸道疾病，防止糖尿病，控制體重，促進維生素和礦物質的吸收.此外，抗性淀粉不會影響食品的風味、質地和外觀，甚至可以提高最終產品的風味.因此，抗性淀粉可作為功能性成分添加于谷物早餐、面包等普通食品以及糖尿病人食品和減肥食品中［2-5］.目前國外對抗性淀粉的研究很深入，而國內尚處于起步階段.抗性淀粉的測定在近20年的研究中出現(xiàn)了許多方法，結果千差萬別，一些方法本身不穩(wěn)定、重現(xiàn)性差.因此，研究抗性淀粉的測定方法具有非常重要的作用.抗性淀粉的測定方法主要有Berry法、Englys法、Bjorck法、Champ法及其改良法、Goni法.國外通常用AOAC法測定抗性淀粉的含量，國內一般采用Goni法.AOAC法和Goni法在測定抗性淀粉含量時，相同點都是先去除可溶淀粉，然后水解抗性淀粉，再測定抗性淀粉中還原糖的含量，最后換算成抗性淀粉的含量.根據抗性淀粉的處理方法，可分為AOAC法和Goni法.根據還原糖的測定方法，又可分為3,5-二硝基水楊酸法（DNS）和D-葡萄糖法（GOPOD）.故抗性淀粉的測定方法有AOAC-GOPOD、AOAC-DNS、Goni-GOPOD、Goni-DNS 4種.本文以木薯抗性淀粉和抗性淀粉標準品為測定對象，對4種方法進行對比，旨在尋找適合木薯抗性淀粉的測定方法.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木薯淀粉：廣西崇左市群力淀粉有限責任公司；抗性淀粉試劑盒：愛爾蘭Megazyme公司；胃蛋白酶：Amresco公司；α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶：丹麥諾維信公司；3，5-二硝基水楊酸、無水葡萄糖、酒石酸鉀鈉、亞硫酸氫鈉等均為分析純.

1.2 儀器與設備

DKZ-450B型恒溫振蕩水槽：上海森信實驗儀器有限公司；Sorvall RC 5C Plus離心機：美國Sorvall公司；GI54D高壓滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；HH-S21-4-S電熱恒溫水浴鍋：上海博泰實驗設備有限公司；791型磁力電熱攪拌器：上海南匯電訊器材廠；HYQ-3110渦旋混勻器：南京暢翔儀器設備有限責任公司；AL104分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FW177中草藥粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；752紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；HI98103筆式pH計：意大利Hanna公司；DF205電熱鼓風干燥箱：北京西城醫(yī)療機械二廠.

1.3 試驗方法

1.3.1 抗性淀粉的制備方法

將一定量的木薯淀粉與水按1∶9混合，攪拌均勻，密封放入高壓滅菌鍋內，120℃處理20 min，4℃靜置24 h，70℃烘干16 h，粉碎，過100目篩.

1.3.2 AOAC法測定抗性淀粉的步驟

準確稱取100 mg樣品，加入4.0 mL α-胰淀粉酶（其中含有AMG 12 U），37℃連續(xù)振蕩16 h，取出，加入4.0 mL無水乙醇，離心(1 500 g，10 min），倒出上清液，沉淀用50%的乙醇至少洗滌2次，合并上清液.將沉淀冰浴，加入2 mL 2 mol/L的KOH，磁力攪拌，然后加入8 mL 1.2 mol/L的醋酸鈉緩沖液（pH3.8），混勻，立即加入0.1 mLAMG，50℃水浴30 min.對于RS含量＜10%的樣品，將處理后的溶液直接離心（1 500 g，10 min）.對于RS含量＞10%的樣品，根據抗性淀粉的含量定容溶液，取少量溶液離心（1 500 g，10 min）［6-8］.用DNS法和GOPOD法測定還原糖的含量.

1.3.3 Goni法測定抗性淀粉的步驟

稱取100 mg的樣品，加入10 mL KCl-HCl緩沖液和胃蛋白酶溶液，40℃振蕩1 h，取出添加加入9 mL 0.1 mol/L Tris-maleate緩沖液，用HCl或者NaOH調節(jié)pH為6.9，加入α-淀粉酶，37℃水浴振蕩16 h，離心（3 000 g，15 min），倒出上清液，用蒸餾水洗滌后，再次離心，合并上清液，重復上述洗滌沉淀和離心步驟.加3 mL的蒸餾水于離心管中，再加入3 mL 4 mol/L KOH溶液，室溫振蕩30 min，加5.5 mL 2 mol/L HCl和3 mL 0.4 mol/L醋酸鈉緩沖液，調節(jié)pH為4.75，加葡萄糖淀粉酶，60℃水浴振蕩45 min，離心，收集上清液于容量瓶中，用蒸餾水洗滌沉淀，離心，合并上清液.根據抗性淀粉的含量定容溶液［9-10］.用DNS法和GOPOD法測定還原糖的含量.

1.3.4 DNS法測定抗性淀粉的步驟

1.3.4.1 葡萄糖標準曲線的繪制

葡萄糖標準溶液：稱取大于100 mg的葡萄糖，103℃干燥至恒重，準確稱取100 mg葡萄糖，用蒸餾水溶解，并定容至1 000 mL［11］.

DNS顯色劑的配制：將1.575 g%3，5-二硝基水楊酸和65.5 mL 2 mol/L NaOH溶液溶解于125 mL含有46.25 g酒石酸鉀鈉的熱溶液中，攪拌均勻，再加入1.25 g結晶酚和1.25 g亞硫酸鈉，冷卻后用蒸餾水定容至250 mL，搖勻后轉移至棕色瓶中，放置1周后備用［12］.

取7支25 mL的具塞試管，按表1混合，再分別加入1.5 mL的DNS溶液，將各試管搖勻后，在沸水浴中加熱5 min，取出后迅速流水冷卻，以蒸餾水定容至25 mL，在540 nm下，以1號管調零，測量2至7號管的吸光度，以吸光度為橫坐標，以葡萄糖含量為縱坐標，繪制標準曲線.

表1 葡萄糖標準溶液的配制

1.3.4.2 DNS法測定抗性淀粉的含量

取1 mL的上清液于25 mL的試管中，加入1 mL蒸餾水和5 mL DNS，將各試管搖勻，在沸水浴中加熱5 min后，用流水迅速冷卻，再用蒸餾水定容至25 mL，測量各溶液的吸光度，利用標準曲線計算出葡萄糖的含量，根據下列公式計算抗性淀粉的含量：

式中：M為葡萄糖含量（由葡萄糖標準曲線求得）；W=分析樣本的干質量=質量×（100-含水量）/100.

1.3.5 GOPOD法測定還原糖含量的步驟

取0.1 mL上清液于試管中，加入3.0 mLGOPOD試劑，50℃孵育20 min.以0.1 mL醋酸鈉緩沖液（pH4.5）和3.0 mL GOPOD為空白試劑，以0.1 mL D-葡萄糖（1 mg/mL）和3.0 mL GOPOD為葡萄糖標準溶液，在510 nm下測量溶液相對于空白試劑的吸光值.抗性淀粉（g/100 g樣品）（樣品包含＞10%RS）=ΔE× F/W×待測液的體積×0.9，

式中：ΔE為相對于空白試劑的吸光度值；F=100（D-葡萄糖的μg數(shù)）/100 μgD-葡萄糖的吸光度值.

2 % 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線(圖1)

2.2 準確性的比較

分別對抗性淀粉含量為53.2%的標準品采用不同的方法測定，結果見表2.

從表2可以看出，Goni法比AOAC法的測定結果偏高，這可能是由于Goni法在酶解可溶性淀粉時未使用葡萄糖淀粉酶導致可溶性淀粉水解不徹底，從而使得測定結果偏高.同時，采用GOPOD法比DNS法測定的還原糖含量偏高，這是由于DNS法測定過程中的諸多影響因素，如吸收波長的大小、顯色時間、顯色劑用量等都會對測定結果的準確性產生影響.該標準品測定結果的允許誤差為±5%，57.583%和51.42%恰好在這一范圍內，故AOAC-GOPOD和AOAC-DNS的準確性

圖1 葡萄糖標準曲線

表2 測定方法準確性的比較

比較高.

2.3 重復性的比較

對抗性淀粉標準品和木薯抗性淀粉分別采用不同的方法測量3次，測量結果見表3和表4.

表3 測定方法重復性的比較 （標準品）%

從表3看出，對于抗性淀粉含量比較高的樣品來說，AOAC-GOPOD和AOAC-DNS的重復性比較好.從表4看出，經過壓熱-冷卻處理之后的木薯抗性淀粉的含量比較低，采用AOAC-DNS法測定結果重復性不好，故對于木薯這類抗性淀粉含量較低的樣品，抗性淀粉的測定方法采用AOAC-GOPOD為好.

表4 淀粉測定方法重復性的比較（木薯抗性淀粉）%

2.4 樣品多少對測量結果的影響

準確稱取100 mg和400 mg的樣品，分別采用4種不同的方法進行測定，結果見表5.%

表5 樣品多少對測量結果的影響%

從表5看出，當樣品為400 mg時，采用Goni法所測定的結果均比100 mg樣品的小，這可能是由于Goni法對酶活力、酶的用量、酶的種類未做出具體的要求.這也說明當對400 mg的樣品進行測定時，酶用量不足.在AOAC法中，當對400 mg樣品進行測定時，沒有出現(xiàn)含量降低的現(xiàn)象，這也充分證明在對100 mg樣品進行測定時，其酶的用量是足量的.

2.5 測定步驟的比較

2.5.1 AOAC法和Goni法的比較

AOAC法和Goni法在測定抗性淀粉含量時，相同點都是先去除可溶性淀粉，然后水解抗性淀粉，再測定抗性淀粉中還原糖的含量，最后換算成抗性淀粉的含量.但Goni法在去除可溶性淀粉前需先去除蛋白質，同時二者在酶的使用方面存在很大的區(qū)別，見表6.

表6 AOAC法和Goni法的比較

AOAC法和Goni法水解可溶性淀粉時都是在37℃條件下連續(xù)振蕩16h，這樣可以充分水解可溶性淀粉中的慢速淀粉，但是AOAC法通過兩種酶的聯(lián)合作用會水解得更徹底，Goni法由于未使用葡萄糖淀粉酶可能會導致可溶性淀粉水解不徹底，有可能導致測定結果偏高.另外，AOAC法在溶解抗性淀粉時，應確保邊加入KOH邊劇烈攪拌樣品，這樣可以避免形成難溶的淀粉塊，同時要使用磁力攪拌器進行攪拌，而不使用渦旋混勻器，以免淀粉乳化的發(fā)生.在水解抗性淀粉時，都使用葡萄糖淀粉酶作用一段時間，攪拌或者渦旋混勻都是為了水解得更充分.通過上述分析，AOAC法操作簡單、準確性高、重復性好，故采用AOAC法處理樣品.

2.5.2 GOPOD法和DNS法測定還原糖含量的比較

抗性淀粉的含量為還原糖的含量乘以0.9在GOPOD反應中，100 μg D-葡萄糖標準品的吸光度是確定的，所以，可以通過在510 nm測定樣品的吸光度值，再通過比例換算，得到抗性淀粉的含量.在DNS反應中，3、5-二硝基水楊酸與還原糖經過共熱后被還原成棕紅色，在一定范圍內，溶液的顏色與還原糖的含量成正比.測定樣品在540 nm下的吸光值，經過相應的換算，就可以得到抗性淀粉的含量，但是由于受到顯色劑的劑量、顯色時間等的影響，導致測定結果重復性較差.

3 結論

AOAC-GOPOD法與其他方法相比，操作簡單，酶用量充足，測定結果重現(xiàn)性較好，準確性較高，是測定木薯抗性淀粉的首選方法.

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STUDY ON RESISTANT STARCH DETERMINATION METHODS

XUE Hui1,2,ZHANG Guo-zhi1,Lü Fei-jie2,TAI Jian-xiang2,Lü Xiao-wen3
(1.School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China; 2.Institute of Crop Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China; 3.Feed Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)%

The resistant starch determination methods include Berry method,Englys method,Bjorck method,Champ method,Goni method,et al.Taking cassava resistant starch and resistant starch standard substance as materials,we compared the resistant starch processing methods(AOAC method and Goni method)and reducing sugar determination methods(3,5-dinitrosalicylic acid method and D-deoxyglucose method)to obtain the optimum cassava resistant starch determination method.We also studied the effects of sample amount on the determination result.The results showed that the AOAC-GOPOD method was simple in operation,and had high accuracy,good repeatability and full enzyme amount,so that the AOAC-GOPOD method was the preferred method.

cassava;resistant starch;measuring method

TS201.2

%A

1673-2383(2012)04-0057-04

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20120829.1722.201204.57_013.html

網絡出版時間：2012-08-29 05:22:00 PM

2012-02-14

國家木薯產業(yè)技術體系（CARS-12-bjlfj）

薛慧（1989—），女，山西呂梁人，碩士研究生，研究方向為新產品開發(fā)與利用.

*通信作者