游荷花，沈敬華

（1.山西醫(yī)科大學 汾陽學院，山西 汾陽032200；2.內蒙古醫(yī)學院，內蒙古 呼和浩特010000）

Myo5a，染色體定位：15q21，是肌球蛋白重鏈12條（MYH12）。它是一種“摩托蛋白”，在細胞內物質運輸中發(fā)揮重要作用，屬于肌球蛋白家族中MyosinV中的一員，是依賴微絲運動參與細胞內物質運輸?shù)?。Myo5a是此家族中新發(fā)現(xiàn)的成員，為肌球蛋白提供了新的研究方向。最近的研究發(fā)現(xiàn)Myo5a可能與一些腫瘤的發(fā)生有關［1］。為進一步研究Myo5a與腫瘤的發(fā)生有無相關性，本研究構建Myo5a特異性片段的原核表達重組質粒PGEX－4T－3／Myo5a，并進行了鑒定，以期為后續(xù)研究Myo5a的作用提供研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料

Myo5aDNA模板，原核表達載體PGEX－4T－3，大腸桿菌菌株DH5α均來自本實驗室。BamHⅠ、XhoⅠ等DNA限制性內切酶，T4DNA連接酶均由Takara公司提供。質粒小量提取試劑盒，膠回收試劑盒均由AXYGEN公司提供。

1.2 設計引物并合成

根據(jù)GenBank的人類Myo5a基因全序列，設計合成一對引物來擴增Myo5a羧基端第5077－5208堿基對長131bp的小片斷。在上游引物PF的5′端添加BamHⅠ識別序列和保護序列，在下游引物PR的5′端添加XhoⅠ識別序列和保護序列。引物序列如下：

PF／BamH Ⅰ 5′－CG／GGATCC／ATGTTCTACATCATAGGG－3′

PR／XhoⅠ5′－CCG／CTCGAG／CAGATTCTTGTCACGCAG－3′

1.3 通過聚合酶鏈式反應（PCR）擴增Myo5a特異性小片斷

在冰上將0.5μL的Myo5aDNA模板，2μL的引物，1μL的dNTP，0.5μL的 DNA 聚合酶（Vent酶），5μL的緩沖液，41μL的DI H20構成50μL體系加入PCR管中。先95℃預變性2 min。然后95℃變性15s，50℃退火30s，72℃延伸45s，此三步循環(huán)30次。然后4℃保溫。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。得到所需擴增片段后使用RCR純化試劑盒提純DNA。

1.4 克隆目的基因

將上述PCR產(chǎn)物、質粒載體PGEX－4T－3分別進行BamH I和X ho I雙酶切，酶切后的產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化；之后利用T4DNA連接酶在4℃過夜條件下將Myo5a基因小片段與質粒載體PGEX－4T－3按一定比例相連接。取連接反應液分別轉化到預先制備的大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細胞，均勻涂布菌液于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平皿上，37℃培養(yǎng)12～16h。

1.5 陽性重組質粒的篩選與鑒定

1.5.1 PCR鑒定重組質粒

從上述LB培養(yǎng)基上隨機挑取數(shù)個菌落，之后分別接種含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的試管中，劇烈振搖培養(yǎng)37℃過夜。從各管中分別取菌液以PF、PR作為引物，直接PCR反應。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，能擴增出Myo5a基因片段者為陽性重組質粒克隆。

1.5.2 酶切鑒定重組質粒

對經(jīng)PCR篩選、鑒定正確的陽性重組質?？寺∮觅|粒小量提取試劑盒提取重組質粒DNA，然后進行BamH I和Xho I雙酶切，鑒定目的基因是否插入載體中，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 基因序列測定鑒定重組質粒

北京諾塞基因組研究中心有限公司使用雙脫氧鏈終止法全自動測序儀對PCR鑒定及酶切鑒定均正確的重組質粒進行測序。

2 結果

2.1 PCR擴增Myo5a基因特異性片段

以人類Myo5a基因全序列為模板，采用PCR技術擴增出與預期大小一致約131bp的DNA片段（圖1）。

2.2 重組質粒的篩選并鑒定

2.2.1 重組質粒的PCR鑒定

對LB平皿上隨機挑取的菌落進行PCR擴增鑒定，大部分擴增出約131bp大小的DNA片段（圖2）。

圖1 PCR產(chǎn)物的電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products expression

圖2 重組質粒的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of the recombinant plasmid expression

2.2.2 重組質粒的酶切鑒定

用BamH I和Xho I對PCR鑒定正確的重組質粒進行雙酶切，可見約4900bp的大片段和約131 bp的目的片段。（圖3）。

圖3 重組質粒的雙酶切鑒定Fig.3 Restriction enzyme digestion identification of the recombinant plasmid expression

3 結論與討論

肌球蛋白V分子是“Y”字結構，有兩條完全相同的重鏈。它由頭部、頸部、尾部3個功能部位組成。頸部較長，尾部較短，每條重鏈頸部有3條調解輕鏈和3條必需輕鏈，而尾部頂端的位點可以和運輸物質相結合［2］。電鏡下看到提純的腦肌球蛋白Va的存在方式是雙頭聚合體［3］。MyosinV是“非傳統(tǒng)”的線性馬達，不同于其它線性馬達，它的頸部區(qū)域較長大約24nm［4］，因而步子比較大。最近研究表明MyosinV類蛋白在無中間絲的情況下，運動“步伐”會變大、同時速度也會變快，提示中間絲網(wǎng)狀結構所形成的粘滯力有可能阻礙了細胞器間的運輸［5］。

Provance等實驗發(fā)現(xiàn)，老鼠的肌球蛋白V基因免疫缺陷時會表現(xiàn)表皮顏色變淡或導瀉，此外，受影響的老鼠會出現(xiàn)嚴重的神經(jīng)問題，幾周后就會死亡，認為沖淡的表皮顏色是由于黑色素顆粒從黑色素細胞到發(fā)光毛發(fā)運輸?shù)娜睋p所致［6～8］。這表明存在于色素細胞中的黑色素的運輸與肌球蛋白V是有關的，肌球蛋白V沿著肌動蛋白微絲連續(xù)運動，此過程利用的是水解ATP產(chǎn)生的自由能。也有研究證明人類“Griscelli病”是因為MyosinV基因突變導致了輕色素沉著，共濟失調以及各種免疫缺陷和神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀［10］。肌球蛋白V在細胞內主要負責有被小泡和黑色素等微粒的運輸。當這種馬達發(fā)生故障時就會導致神經(jīng)或免疫等方面的疾?。?］。近幾年的研究又發(fā)現(xiàn)Myo5a可能與一些腫瘤的發(fā)生有關。

本研究用多聚酶鏈式反應（PCR）擴增出Myo5a基因特異性片段的蛋白編碼序列，經(jīng)BamH I和Xho I進行雙酶切后，將此片段插入原核表達載體pGEX－4T－3，構建重組子PGEX－4T－3／Myo5a。通過PCR、限制性酶切和基因測序3種方式證實獲得了原核重組載體PGEX－4T－3／Myo5a，不僅可以為后續(xù)研究Myo5a的作用提供研究工具，同時也可以為深入研究非常規(guī)肌球蛋白在腫瘤細胞轉移中的作用及其分子調控機制提供理論基礎。

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