許曄瓊，李瑞，高天翼，顧玲，聶珍琳，陳麗萍，宋國齊，王書奎

南京醫(yī)科大學附屬南京第一醫(yī)院中心實驗室，江蘇 南京 210006

0 前言

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率占女性惡性腫瘤的7%～10%，僅次于宮頸癌，近年來乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。雖然其病因研究不甚清楚，但可以確定的是肥胖在其發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。有肥胖傾向的女性，在患乳腺癌以后，病史兇險且預后不良[2]。流行病學研究揭示了過重和肥胖可能和絕經期婦女乳腺癌發(fā)病率升高有關[3-4]。很多假設已經解釋了兩者的相關性。如肥胖是由于在絕經期間脂肪組織產生雌激素過多，導致了血清中高水平的循環(huán)胰島素和類胰島素生長因子，從而與代謝綜合征相關。而且，過高的雌激素會刺激脂肪細胞因子水平的升高，將促進乳腺癌的發(fā)展[5]。

瘦素（lentin，LP）是肥胖基因（obese gene，OB）所編碼的蛋白產物，主要由白色脂肪組織分泌，是包含167個氨基酸的蛋白活性因子，它在能量消耗、體內脂肪平衡和生殖方面起著重要的作用[6-7]。近年來的研究已經證實LP參與了乳腺組織的癌變過程，同時也參與了乳腺癌細胞的增殖和血管新生的過程[8-10]。LP通過與其受體結合發(fā)揮作用，LP受體是單跨膜受體，包括胞外、跨膜和胞內3個結構域。根據胞內結構域氨基酸序列及不同長短，將其分為長受體和短受體2種亞型[11]。LP受體在人體內廣泛分布于下丘腦、神經、心臟、腎臟、乳房、肺、肝臟、脂肪組織及胰島細胞表面。據報道LP受體的功能和LP相似[9,12]。LEPR位于1號染色體上，由LEPR轉錄得到幾個交互的亞型（一個長亞型和幾個短亞型），長亞型LEPR-b起信號轉導的作用。一些LEPR的多態(tài)性已經被證實[13-17]，如存在于LEPR有2個公認的LP結合位點，其中的一個位點上谷氨酸轉變?yōu)榫彼?，這可能與LEPR信號轉導能力受損有關[18]。

迄今為止，許多研究已經報道Gln223Arg（rs1137101）多態(tài)性和乳腺癌易感性的關系，但是這些研究的結論相互矛盾，包括研究人群和試驗設計。為了評估LEPR Gln223Arg多態(tài)性與乳腺癌關系的總體危險性，鑒定可能存在的組間異質性，我們進行了包括8個病例對照研究的meta分析，其中包括了2610個乳腺癌患者和3656個正常對照組。

1 材料和方法

1.1 文獻檢索和質量評估

本文納入標準如下：① 文獻研究的內容是LEPR Gln223Arg多態(tài)性與乳腺癌危險性的關系；② 文獻是病例對照研究；③ 文獻能夠提供計算OR值和95%可信區(qū)間（95%CI）的相關數據。

本文主要搜索了相關的生物醫(yī)學數據庫，包括MEDLINE，EMBASE和詢證醫(yī)學圖書館數據庫，截止時間為2010年10月18 日。檢索關鍵詞為“l(fā)eptin receptor/LEPR”“polymorphism”和“breast cancer”。由兩位研究者分別對本文中檢索的文獻研究質量進行評估。檢索納入文獻和綜述中的參考文獻來尋找其他符合要求的文獻。

1.2 數據提取

兩位研究者獨立地提取數據，當對同一篇文獻有異議時，通過討論達成一致。對任何一篇文獻盡可能提取如下的信息：第一作者、發(fā)表年限、國籍、種族、絕經情況、對照來源、病例和對照各基因型的樣本量。不同的種族人群劃分為歐洲人群、非洲黑人和東亞人群。如果文獻中沒有具體數據，發(fā)郵件給通訊作者以獲得所需數據。

1.3 統(tǒng)計分析

用OR值和相應的95%CI來評價LEPR Gln223Arg多態(tài)性與乳腺癌危險性的關聯強度?？傮w合并OR值分別用于共顯性模型（Arg/Arg vs Gln/Gln；Arg/Gln vs Gln/Gln）、顯性模型（Arg/Arg+Arg/Gln vs Gln/Gln）和隱性模型（Arg/Arg vs Arg/Gln+Gln/Gln）。同時，根據統(tǒng)計資料運用統(tǒng)計學方法評價研究中的異質性[19]。當沒有組間異質性時，Q檢驗的P值>0.05，用固定效應（Mantel-Haenszel）模型來求合并效應[20]，反之，用隨機效應（DerSimonian and Laird）模型[21]。除此之外，種族和絕經情況也用于分組分析?？赡艽嬖诘陌l(fā)表性偏倚形象地用log[OR]比標準誤（SE）的漏斗圖表示，不對稱程度用Egger’s檢驗表示[22]。本篇meta分析運用STATA 10.0和Review Manager軟件分析。所有檢驗均為雙側，當P<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

1.4 主要方法

本文中納入的文章主要運用了以下5種方法：

（1）聚合酶鏈反應和限制性片段長度多態(tài)性（PCRRFLP）：是用PCR儀擴增目的DNA片段，擴增產物用特異性內切酶消化切割成不同大小片段，經過凝膠電泳，在凝膠成像與分析系統(tǒng)上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，產生不同長度的DNA片段條帶。

（2）直接測序法：是利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套4個單獨的反應構成，每個反應含有所有4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千個堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X- 光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

（3）Taqman：Taqman熒光探針是一寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光發(fā)射基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時，發(fā)射基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團和淬滅基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增1條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步，從而實現定量。

（4）SNP-it：是一個具有全面的聯合數據庫的方法，來預測一系列的可能具有功能的多態(tài)性位點。SNP-it提供用戶關于單核苷酸多態(tài)性功能的最新信息。同時它可以從全基因組關聯研究的結果整合和分析潛在單核苷酸多態(tài)性的功能。

（5）TDI-FP：以特異探針及熒光素標記的ddNTP為底物，在DNA聚合酶及其緩沖液中循環(huán)雜交延伸后，應用熒光偏振技術可以測量平面偏振光激發(fā)后產生的水平和垂直的熒光。當熒光染料被平面偏振光激發(fā)后發(fā)生熒光偏振，由于大分子較小分子旋轉得慢，熒光標記的Acyclo終止堿基摻入寡核苷酸引物下游后偏振值將增加，故由此來確定哪一種熒光標記的Acyclo終止堿基已被摻入整合。

1.5 主要儀器設備

2 結果

2.1 納入文獻的基本情況

根據納入標準，一共有8篇已發(fā)表文獻符合要求，其中包括2610個病例和3656個對照。有2篇研究亞洲人群，4篇研究歐洲人群，2篇研究非洲人群。3篇研究運用了聚合酶鏈反應和限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）的方法，其他研究分別運用了直接測序法、Taqman、SNP-it和TDIFP。所有研究中的乳腺癌患者都經過組織學和病理學的確認。此外，對照組在年齡上與病例組相匹配，其中5篇研究中對照組是以健康人群為基礎，1篇研究中對照組是以無疾病或者無相關疾病的醫(yī)院病人為基礎，另外1篇研究是以良性乳腺疾病的人群為基礎。所有研究除了1篇來自Han等[23]的研究中對照組的基因型分布都符合Hardy-Weinberg平衡（HWE）。我們用觀察到的數據計算預期分布時發(fā)現，1篇研究不符合HWE（對照組：χ2=11.01，P<0.001），見表1。

2.2 主要結果

這篇meta分析的的主要研究結果見表2。當所有符合要求的文獻在此meta分析中研究時，我們發(fā)現隱性模型（OR=1.32，95%CI：1.03～1.69）和基因型Arg/Gln vs Gln/Gln（OR=1.16，95%CI：1.01～1.34）會增加乳腺癌的危險性。以種族分層的研究中，發(fā)現非洲人群中的基因型Arg/Arg vs Gln/Gln（OR=1.86，95%CI：1.28～2.71），Arg/Gln vs Gln/Gln（OR=1.48，95%CI：1.10～1.99），顯性模型（OR=1.60，95%CI：1.21～2.11）和隱性模型（OR=1.48，95%CI：1.07～2.05）能增加乳腺癌發(fā)生的危險性；亞洲人群中，Arg/Arg vs Gln/Gln（OR=6.79，95%CI：3.42～13.47）和顯性模型（OR=2.03，95%CI：1.42～2.90）能增加乳腺癌發(fā)生危險性。在歐洲人群中任何基因型與乳腺癌危險性都沒有發(fā)現統(tǒng)計學意義。

2.3 發(fā)表性偏倚

漏斗圖和Egger’s檢驗用來評價發(fā)表性偏倚。漏斗圖的形狀沒有明顯的不對稱，Egger’s檢驗也沒有發(fā)現發(fā)表性偏倚（P>0.05）。

3 討論

流行病學研究顯示過重和肥胖可能和女性子宮內膜癌、腎癌、結腸癌和膽囊癌和絕經期女性的乳腺癌相關[24]，同時會增加癌癥的病死率[25]。LP和LP受體在調節(jié)體重和肥胖上起著重要作用[26-27]，已經有報道證明乳腺癌患者血清中LP水平比對照組明顯升高[28-29]。積累的數據證明人類乳腺癌細胞系和乳腺腫瘤能夠表達LP和LP受體[9,30-31]。先前的報道也證明LEPR的基因多態(tài)性影響乳腺癌易感性，同時發(fā)現LEPR 223Arg等位基因頻率在病例組顯著高于對照組[28,32]。但其他研究并沒有發(fā)現相似的關系[33-34]。為了分析矛盾的結論，我們進行了這個meta分析，用來獲得更精確的相關性。結果表明LEPR 223Arg是乳腺癌的一個潛在危險因素，同時非洲人群中發(fā)生乳腺癌的危險性高于亞洲和歐洲人群。

目前的研究發(fā)現，在總體人群中LEPR多態(tài)性與乳腺癌的危險性有陽性相關性。我們發(fā)現種族分層研究中有不同的結果。在非洲和亞洲人群中，LEPR 223Arg是乳腺癌的危險因素。相反，在歐洲人群中，LEPR 223Arg與乳腺癌無關，這表明不同的種族在基因遺傳背景和地理環(huán)境上的差異在LEPR Gln223Arg多態(tài)性和乳腺癌危險性的關系上起著重要的作用。兩個被公認的LP結合位點，其中之一的LEPR Gln223Arg多態(tài)性可能和LEPR信號轉導能力的損傷有關[18]。且許多研究推斷與LP通道相關的肥胖是乳腺癌的危險因素，但在不同人群研究中，肥胖只能部分地解釋LEPR Gln223Arg多態(tài)性與乳腺癌危險性的不同關系。

本文中僅有4篇文獻研究非洲人群和亞洲人群。因此，需要更多的研究來證實種族之間的差異。以不同的絕經狀態(tài)分層分析，我們沒有發(fā)現任何的相關性。LP通道被認為是絕經后發(fā)生乳腺癌的重要因素，僅僅是因為LP是脂肪組織產生的蛋白質，其轉錄調控是由孕酮在內的性激素調節(jié)的。然而，其他的研究并沒有證實類似的相關性[33]。我們需要更多的研究來揭示LP通道上的基因多態(tài)性和乳腺癌相關性的機制。

表1 納入meta分析的8個研究的基本情況匯總

表2 LEPR Gln223Arg多態(tài)性與乳腺癌危險性分層分析

本篇meta分析仍然存在著一些局限，① 這個分析中的對照組不統(tǒng)一。大多數的對照是健康人群，而另一些是病人。一些對照尤其是那些有良性乳腺疾病的人患乳腺癌的危險性不同。② 在亞組分析時，亞洲和非洲都各只有兩篇文獻，樣本量太小以致不能發(fā)現潛在的關聯性。③ 只有8篇文獻納入了這篇meta分析中，并且存在組間異質性。因此，除了基因型AG和AA之間的比較，其余OR都是運用隨機模型計算的。④ 具體信息（如年齡、性別和生活方式）不能被溯源，所以我們未經校準的結果需要更多的研究來確證。

總之，meta分析表明LEPR 223Arg是非洲和亞洲人群中乳腺癌發(fā)展的一個低風險因素，而在歐洲人群中并沒有發(fā)現兩者的相關性，這表明其中的關聯可能和種族差異有關。為了能使我們更好的理解，需要有更大樣本量的研究來闡明LEPR Gln223Arg多態(tài)性和乳腺癌危險性的關系。

[1]張金英,林季,顏光濤.瘦素與乳腺癌的關系研究進展[J].標記免疫分析與臨床,2009,16(1):59-61.

[2]白慶陽,谷俊朝,俞麗鴻.瘦素與乳腺癌的相關性及其致癌機理[J].國際外科學雜志,2008,35(1):37-40.

[3]Berclaz G,Li S,Price KN,et al.Body mass index as a prognostic feature in operable breast cancer: the international breast cancer study group experience[J].Ann Oncol,2004,15(6):875-884.

[4]Asseryanis E,Ruecklinger E,Hellan M,et al.Breast cancer size in postmenopausal women is correlatedwith body mass index and androgen serum levels[J].Gynecol Endocrinol,2004,18(1):29-36.

[5]Lorincz AM,Sukumar S.Molecular links between obesity and breast cancer[J].Endocr Relat Cancer,2006,13(2):279-292.

[6]Tritos NA Mantzoros CS.Leptin: its role in obesity and beyond[J].Diabetologia,1997,40(12):1371-1379.

[7]Barash IA,Cheung CC,Weigle DS,et al.Leptin is a metabolic signal to the reproductive system[J].Endocrinology,1996,137(7):3144-3147.

[8]Miyoshi Y,Funahashi T,Tanaka S,et al.High expression of leptin receptor mRNA in breast cancer tissue predicts poor prognosis for patients with high, but not low, serum leptin levels[J].Int J Cancer,2006,118(6):1414-1419.

[9]Ishikawa M,Kitayama J,Nagawa H.Enhanced expression of leptin and leptin receptor (OB-R)in human breast cancer[J].Clin Cancer Res,2004,10(13):4325-4331.

[10]Catalano S,Marsico S,Giordano C,et al.Leptin enhances,via AP-1,expression of aromatase in the MCF-7 cell line[J].J Biol Chem,2003,278(31):28668-28676.

[11]謝小強,王弦,曹亮,等.瘦素與乳腺癌相關性研究進展[J].安徽醫(yī)藥,2008,12(3):193-195.

[12]Garofalo C,Koda M,Cascio S,et al.Increased expression of leptin and the leptin receptor as a marker of breast cancer progression: possible role of obesity-related stimuli[J].Clin Cancer Res,2006,12(5):1447-1453.

[13]Chung WK,Power-Kehoe L,Chua M,et al.Mapping of the OB receptor to 1p in a region of nonconserved gene order from mouse and rat to human[J].Genome Res,1996,6(5):431-438.

[14]Gotoda T,Manning BS,Goldstone AP,et al.Leptin receptor gene variation and obesity: lack of association in a white British male population[J].Hum Mol Genet,1997,6(6):869-876.

[15]Chung WK,Power-Kehoe L,Chua M,et al.Exonic and intronic sequence variation in the human leptin receptor gene (LEPR)[J].Diabetes,1997,46(9):1509-1511.

[16]Thompson DB,Ravussin E,Bennett PH,et al.Structure and sequence variation at the human leptin receptor gene in lean and obese Pima Indians[J].Hum Mol Genet,1997,6(5):675-679.

[17]Matsuoka N,Ogawa Y,Hosoda K,et al.Human leptin receptor gene in obese Japanese subjects: evidence against either obesitycausing mutations or association of sequence variants with obesity[J].Diabetologia,1997,40(10):1204-1210.

[18]Yiannakouris N,Yannakoulia M,Melistas L,et al.The Q223R polymorphism of the leptin receptor gene is significantly associated with obesity and predicts a small percentage of body weight and body composition variability[J].J Clin Endocrinol Metab,2001,86(9):4434-4439.

[19]Handoll HH.Systematic reviews on rehabilitation interventions[J].Arch Phys Med Rehabil,2006,87(6):875.

[20]Mantel N,Haenszel W.Statistical aspects of the analysis of data from retrospective studies of disease[J].J Natl Cancer Inst,1959,22(4):719-748.

[21]DerSimonian R,Laird N.Meta-analysis in clinical trials[J].Control Clin Trials,1986,7(3):177-188.

[22]Egger M,Davey Smith G,Schneider M, et al.Bias in meta-analysis detected by a simple,graphical test[J].BMJ,1997,315(7109):629-634.

[23]Han CZ,Du LL,Jing JX,et al.Associations among lipids,leptin and leptin receptor gene Gin223Arg polymorphisms and breast cancer in China[J].Biol Trace Elem Res,2008,126(1-3):38-48.

[24]Bianchini F,Kaaks R,Vainio H.Overweight,obesity and cancer risk[J].Lancet Oncol,2002,3(9):565-574.

[25]Calle EE,Rodriguez C,Walker-Thurmond K,et al.Overweight,obesity and mortality from cancer in a prospectively studied cohort of U.S. adults[J].N Engl J Med,2003,348(17):1625-1638.

[26]Antunes H,Santos C,Carvalho S.Serum leptin levels in overweight children and adolescents[J].Br J Nutr,2009,101(8):1262-1266.

[27]Hroussalas G,Kassi E,Dalamaga M,et al.Leptin, soluble leptin receptor,adiponectin and resistin in relation to OGTT in overweight/obese postmenopausal women[J].Maturitas,2008,59(4):339-349.

[28]Snoussi K,Strosberg AD,Bouaouina N,et al.Leptin and leptin receptor polymorphisms are associated with increased risk and poor prognosis of breast carcinoma[J].BMC Cancer,2006,20(6):38.

[29]Ozet A,Arpaci F,Yilmaz MI,et al.Effects of tamoxifen on the serum leptin level in patients with breast cancer[J].Jpn J Clin Oncol,2001,31(9):424-427.

[30]Hu X,Juneja SC,Maihle NJ,et al.Leptin-a growth factor in normal and malignant breast cells and for normal mammary gland development[J].J Natl Cancer Inst,2002,94(22):1704-1711.

[31]Laud K,Gourdou I,Pessemesse L,et al.Identification of leptin receptors in human breast cancer:functional activity in the T47-D breast cancer cell line[J].Mol Cell Endocrinol,2002,188(1-2):219-226.

[32]Okobia MN,Bunker CH,Garte SJ,et al.Leptin receptor Gln223Arg polymorphism and breast cancer risk in Nigerian women: a case control study[J].BMC Cancer,2008,(8):338.

[33]Teras LR,Goodman M,Patel AV,et al.No association between polymorphisms in LEP, LEPR, ADIPOQ, ADIPOR1 or ADIPOR2 and postmenopausal breast cancer risk[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2009,18(9):2553-2557.

[34]Woo HY,Park H,Ki CS,et al.Relationships among serum leptin,leptin receptor gene polymorphisms and breast cancer in Korea[J].Cancer Lett,2006,237(1):137-142.