趙書宇，劉海英，沈 鵬，金正勛，張忠臣，張海彬，王露露

（東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030）

胚乳是水稻的主要食用部位，胚乳的形成和發(fā)育直接影響著水稻的產(chǎn)量和品質[1]。胚乳的主要成分是淀粉和蛋白質，因此，籽粒灌漿過程也是淀粉和蛋白質的合成與積累過程，在此過程中眾多的酶參與其中。有效地分離和鑒定灌漿過程中胚乳的蛋白質對深入了解稻米品質形成的生化學機理具有十分重要的意義。近年來，迅速發(fā)展的蛋白質組學能使我們更深刻地了解蛋白質的功能及其相互調控機制，而且在逆境生理、雜種優(yōu)勢、品質研究中的應用也較廣泛[2]。單彩云對470份國內(nèi)外大豆資源進行室內(nèi)分級篩選，并對耐低溫資源綏農(nóng)14的子葉和真葉進行低溫處理，利用2D技術尋找耐低溫相關蛋白。在綏農(nóng)14子葉處理試驗中，處理與對照表達量相差3.5倍以上的蛋白質點共獲得29個，其中4℃處理上調表達有13個點，下調表達蛋白質點16個[3]。白月等用雙向電泳技術分析水稻少側根突變系MT10及其野生型IR8的根系全蛋白質組，建立二者間的差異表達圖譜，得到了11個差異點，其中只在MT10中表達的蛋白點有2個，只在IR8中表達的蛋白點有4個，兩者間有明顯差異的蛋白點有5個[4]。劉文文等應用雙向電泳（2-DE）技術分析了烯丙異噻唑誘導后水稻蛋白質的差異表達，在誘導4 d的雙向電泳圖譜上找到了10個差異表達蛋白質點，選取其中3個進行質譜（MALDI-TOF-MS）分析，分別具有泛醌-細胞色素C還原酶、蘇氨酸肽鏈內(nèi)切酶和蘋果酸脫氫酶活性[5]。

雙向電泳技術是蛋白質組學的核心技術，它包括蛋白質的提取、純化、等電聚焦和SDS-PAGE電泳、凝膠染色、圖像分析等技術[6]。其中蛋白質提取和上樣量大小、膠條轉移等對蛋白質分離效果影響很大。郝強等以北海道黃楊為模型植物，比較了TCA/丙酮法、酚法和酚/SDS法三種蛋白質提取方法，結果表明三種提取方法使得電泳結果相差很大，而改進的酚/SDS法所得結果最好[7]。

本試驗選用水稻抽穗后10 d的籽粒，采用不同的蛋白質提取方法和上樣量、膠條轉移等對胚乳蛋白質進行分離效果比較分析，旨在建立適用于水稻胚乳蛋白質的雙向電泳技術體系，為分離鑒定水稻胚乳蛋白質提供技術平臺。

1 材料與方法

1.1 材料

選用東農(nóng)08-18穩(wěn)定品系的直鏈淀粉含量不同的兩個材料進行盆栽試驗。盆規(guī)格為直徑25 cm，高度30 cm，每盆4棵生長一致的秧苗，穴間距一致，每個材料重復3次，按常規(guī)方法進行肥水管理。抽穗時選取同一天抽穗掛牌標記，抽穗后10 d取掛牌標記的5個穗，取穗中上部灌漿一致的籽粒，剝?nèi)シf殼置于凍存管中-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 水稻胚乳蛋白的提取

1.2.1.1 TCA-丙酮法

取凍存籽粒20粒，用滅菌預冷的剪刀和鑷子在預冷的研缽中迅速剝?nèi)シN皮，切去胚，加0.2%PVP迅速研磨至糊狀，懸浮于含0.07%DTT的預冷10%TCA-丙酮，-20℃過夜。次日4℃35 000 r·min-1離心15 min，棄上清，將沉淀重懸于80%丙酮，于-20 ℃溫浴l h，4 ℃ 16 000 r·min-1離心15 min。沉淀重懸于100%丙酮，于-20℃溫浴l h，4℃16 000 r·min-1離心15 min。重復此步驟2～4次，倒出上清液，離心管置于冰浴中抽真空15 min至丙酮完全揮發(fā)，得到的蛋白為粗蛋白。

1.2.1.2 酚法

參照易克等方法[8]，取凍存籽粒20粒，加5倍體積提取緩沖液及0.5%PVP。12 000 r·min-1離心10 min，取上清液。加入等體積的水飽和酚（pH 8.0），充分振蕩，靜置10 min后，12 000 r·min-1離心5 min。取酚相液體，加入5倍體積0.1 mol·L-1乙醇銨，置于-20℃下30 min，充分洗滌沉淀4次以上，除盡乙醇銨，冷凍抽干，所得干粉為粗蛋白。

1.2.2 蛋白裂解及含量測定

用離心管稱取30 mg粗蛋白干粉，向干粉中加入 500 μL 裂解緩沖液（8 mol·L-1urea，2 mol·L-1thiourea，4%CHAPS，2.5%pH 4～7 IPG buffer，1%DTT），36℃溫浴1 h，離心時間取上清，其余兩份作為該樣品的重復。采用Bradford法進行蛋白定量[5]，以蛋白質裂解液為空白，1 mg·mL-1的牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BAS）標準蛋白（標準蛋白溶液用蛋白質裂解液配制）為標準，在紫外-可見分光光度計下測定595 nm的吸光值，繪制標準曲線，用于計算蛋白質樣品的含量。

1.2.3 雙向電泳

1.2.3.1 樣品被動上樣及等電聚焦

選用17 cm IPG膠條（pH 4～7）。IPG干膠條膠面朝下放入水化液的水代盤中，覆蓋一層礦物油以防止等電聚焦時尿素析出，蛋白氧化及產(chǎn)生冷凝水，被動水化14 h后，置于Bio-Rad等電聚焦儀中，等電聚焦在20℃條件下自動進行，每膠條限流50 μA。等電聚焦參數(shù)如下：

①500 V 4 h 除鹽；

②1 000 V 1 h 線性上升（Gra）；

③8 000 V 2.5 h 線性上升（Gra）；

④8 000 V 0.5 h聚焦。

1.2.3.2 膠條的平衡

將等電聚膠后的膠條膠面向上置于5 mL平衡緩沖液Ⅰ（50 mmol·L-1Tris-HCL，pH 8.8，6 mol·L-1urea，30%甘油，2%SDS，0.002%溴酚藍，1%DTT）中平衡搖床震蕩15 min，然后再置于5 mL平衡緩沖液Ⅱ（50 mmol·L-1Tris-HCL，pH 8.8，6 mol·L-1urea，30%甘油，2%SDS，0.002%溴酚藍，2.5%碘乙酰胺）中平衡15 min，取出后放在濕潤的定性濾紙上，以吸去表面多余的液體。

1.2.3.3 SDS-PAGE

采用Bio-Rad垂直電泳系統(tǒng)，膠的濃度為12%，將平衡后的膠條放置于已聚合的聚丙烯酰胺凝膠膠面上，用0.5%的低熔點瓊脂糖封頂液封閉排除氣泡。在電泳槽中加入約1.5 L電泳緩沖液（0.025 mol·L-1Tris， 0.192 mol·L-1Glyeine， 0.1%SDS）第一步每塊膠10 mA下電泳30 min，第二步每塊膠20 mA下電泳至溴酚藍前沿距離玻璃板下緣0.5 cm時停止電泳。

1.2.3.4 考馬斯亮藍染色

電泳后將凝膠立即放入固定液（40%甲醇，l0%乙酸）中至少30 min，可過夜；充分固定后用Millipore純凈水洗2次，每次5 min；換置考馬斯亮藍染液（10%硫酸銨，10%磷酸，20%甲醇，0.06%考馬斯亮藍G250染色，至少2 h；用脫色液（25%乙醇，8%乙酸）脫去底色，或者直接用Millipore純凈水脫色，直到蛋白點清晰為止。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法對胚乳蛋白分離效果的影響

蛋白質樣品制備是雙向凝膠電泳最為關鍵的步驟之一。樣品制備中關鍵為有效的去除淀粉等干擾成分，盡可能擴大其溶解度和解聚，盡量減少蛋白提取過程中的降解和丟失，以提高分辨率。圖1A、B分別為利用TCA-丙酮法和酚法提取蛋白質的電泳結果。通過比較圖1A和B可以看出，不同的蛋白質提取方法對雙向電泳的分離效果有較大影響。使用PD Quest分析軟件對圖1A、B進行分析，圖1A共檢測到蛋白點數(shù)（321±5）個，圖1B共檢測到蛋白點數(shù)（195±5）個，而且TCA-丙酮提取法的雙向電泳結果清晰度明顯好于酚法結果，酚法樣品在等電聚焦過程中電壓未能達到8 000 V，這可能是由于酚法提取的蛋白樣品會混有比較多的鹽離子，影響了聚焦效果。

2.2 不同上樣量對胚乳蛋白分離效果的影響

上樣量大小對電泳結果的清晰程度有很大的影響。上樣量太小，低豐度蛋白就無法被識別；相反，如果上樣量過大，雖然可以看到低豐度蛋白，但是會導致一些蛋白點過大而多點重合，為分析造成困難。圖2中A、B、C分別是100、300、500 μg三種上樣量的電泳結果。通過比較可以看出，100 μg上樣量的電泳圖上共檢測到蛋白點數(shù)為（102±5）個，幾乎看不到低豐度蛋白，而且其背景要深于圖2B和C；而500 μg上樣量的電泳圖上共檢測到蛋白點數(shù)（310±5）個，有明顯的橫紋且橫向分離效果不好，放大區(qū)域可以看到有些點重合在一起。而300 μg上樣量的電泳圖上共檢測到蛋白點數(shù)（331±5）個，蛋白點數(shù)與500 μg上樣量結果相差不多，但是圖像清晰沒有橫紋和過大的蛋白點，便于分析。

圖1 不同蛋白提取方法的雙向電泳結果Fig.1 Two-dimensional gel electrophoresis result of sample in different extraction method

2.3 膠條的轉移與封閉對胚乳蛋白分離效果的影響

等電聚焦完成后，將IEF膠條轉移到第二向SDS-PAGE這一過程同樣是雙向電泳的關鍵過程之一，主要涉及IEF膠的固定和平衡以及包埋[9]。在這個過程中最容易出現(xiàn)膠條不平整和蛋白質擴散的問題，從而影響電泳的分辨率和準確度，應該加以精細的操作和調控。如圖3所示，左邊圖中為包埋不平整的電泳圖片，可以明顯看出圖中標出區(qū)域中的蛋白點相對右邊包埋較好的圖片中同一區(qū)域的蛋白點位置發(fā)生了偏移，而且向中間聚集。影響了電泳圖片的比對和分析。這可能是由于在加入封頂液時產(chǎn)生了較大的氣泡造成的。

圖2 不同上樣量的樣品雙向電泳結果Fig.2 Two-dimensional gel electrophoresis results of different samples loaded quantity

圖3 不同包埋效果的雙向電泳結果比較Fig.3 Comparison of two-dimensional gel electrophoresis by different embedding dispose

3 討論與結論

3.1 水稻胚乳蛋白的提取

蛋白樣品的提取和制備是進行蛋白質組學分析的關鍵步驟，蛋白樣品的純度和再溶性直接影響雙向電泳（2-DE）分離結果的清晰度和重復性[10]。一般的蛋白質樣品制備過程常采用丙酮、三氯乙酸或硫酸銨進行沉淀[11]。本試驗比較了TCA-丙酮法和酚法提取水稻胚乳蛋白的雙向電泳結果，發(fā)現(xiàn)利用TCA-丙酮提取蛋白，不僅提取效率高，而且雜質干擾少，得到的電泳結果，蛋白條帶清晰，數(shù)量較多。酚法雖然所得到的蛋白再溶性要好于TCA-丙酮法，但是樣品中混雜的鹽離子等小分子雜質較多，使得等電聚焦不容易上升到設定的最高電壓。當然這種影響可以通過多次溶解來去除，但是這樣會損失一些低豐度蛋白，也有違提取操作盡量簡單的原則。因此，綜合考慮應該選擇TCA-丙酮法。

TCA-丙酮法所得的粗蛋白很多，但是再溶解性較差。在對粗蛋白用裂解液溶解的時候，可以用多個離心管同時溶解，離心取上清時合并同一樣品，這樣可以加大溶解效率，減小蛋白樣品中不溶物的干擾。

提取的整個過程要在低溫條件下進行，以防止蛋白被蛋白酶降解。由于要提取的是水稻籽粒的胚乳蛋白，為避免引入種皮和胚中蛋白的干擾，就要把種皮和胚完全去掉，這個過程要盡可能快速且在預冷的研缽中完成，所用的鑷子和剪刀要滅菌預冷。由于操作精細，可以事先多加練習以加快操作速度。

3.2 上樣量的選擇

上樣量的選擇是一個比較精細的工作，有的時候僅僅相差幾十微克的上樣量，所得到的電泳結果卻相差很大。因此，需要在參考前人實驗結果的同時，還應該對上樣量進行多次試驗和摸索，對結果進行多次比較，從而確定最佳上樣量[12]。本試驗比較了100、300、500 μg三種不同上樣量的雙向電泳的結果，發(fā)現(xiàn)在上樣量為300 μg時，得到最多的蛋白點數(shù)和背景清晰的電泳圖。這是由于，在電泳槽中加入含有100 μg胚乳蛋白的水化液時，由于蛋白質含量較少，很多低豐度的蛋白雖然存在，卻不能被分離出來。這樣所得的圖像就如圖2A所示，只有一些高豐度蛋白能被看到，而且背景相對要深一些。如果上樣量達到過高，反而蛋白點要少，這是因為聚焦過程中蛋白質濃度過高而在膠槽中沉淀，不能很好地進入IPG膠條中造成的[13]。

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