許蘭嬌 黎觀紅 瞿明仁 游金明 易中華

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南昌 330045)

泰和烏骨雞與其他品種家雞相比，最顯著的區(qū)別是其體內(nèi)含有大量的黑色素。泰和烏骨雞的入藥效果與其黑色素含量有關(guān)，顏色愈黑，入藥愈佳[1]。體內(nèi)的黑色素是酪氨酸在酶的催化下，經(jīng)過一系列復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化過程而形成的[2]。其中，酪氨酸酶是黑色素生成的關(guān)鍵酶和限速酶，其活性決定著黑色素合成的速度和產(chǎn)量[3]。酪氨酸酶是一種銅結(jié)合金屬酶，化學(xué)結(jié)構(gòu)為銅結(jié)合糖蛋白[4]。由此推斷，飼糧中銅水平可能會影響烏骨雞體內(nèi)黑色素的含量及相關(guān)酶(如酪氨酸酶)的活性。目前，國內(nèi)外尚未見到有關(guān)于飼糧銅添加水平對泰和烏骨雞組織黑色素合成及相關(guān)指標(biāo)影響的報(bào)道。為此，本試驗(yàn)旨在通過研究飼糧銅添加水平對1～28日齡泰和烏骨雞生產(chǎn)性能和組織黑色素含量及相關(guān)酶活性的影響，為確定泰和烏骨雞飼糧適宜銅添加量和飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用健康、體重均勻的1日齡泰和烏骨雞270只，隨機(jī)分成6組，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)15只雞，飼養(yǎng)至28日齡。各組雞初始體重?zé)o顯著差異(P＞0.05)。采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，分別在基礎(chǔ)飼糧中添加 0、5、15、30、60、125 mg/kg 銅。銅源為飼料級硫酸銅(CuSO4·5H2O，純度98%，含銅25%)。

1.2 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧參考NRC(1999)家禽營養(yǎng)需要和本實(shí)驗(yàn)室以往泰和烏骨雞營養(yǎng)需要研究結(jié)果進(jìn)行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1，其銅本底含量為4.75 mg/kg(實(shí)測值)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2010年5月10日至2010年6月7日在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物營養(yǎng)研究基地進(jìn)行。試驗(yàn)各組飼養(yǎng)條件完全相同。采取隨機(jī)分層立體飼養(yǎng)，自由采食，自由飲水(前3天在雞的飲水中加入多維和葡萄糖)，用紅外燈24 h保溫，第1周育雛室室溫控制在34～35℃，以后每周下降2℃，濕度保持在55% ～65%。定期清理打掃雞舍衛(wèi)生并消毒，每天沖洗飲水器。按照正常免疫程序進(jìn)行免疫。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 生產(chǎn)性能指標(biāo)

于28日齡晨喂前空腹12 h逐只稱重，記錄各重復(fù)的飼料消耗量，計(jì)算平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.4.2 血液樣品采集與制備

28日齡時，從每個重復(fù)中選3只(共54只)健康狀況良好、接近平均體重的烏骨雞，于清晨空腹12 h稱重后，翅靜脈采集血液約15 mL于20 mL EP管中，室溫靜置30 min后，3 500 r/min離心3 min，取得血清并分裝，-20℃冰箱保存，用于血清酪氨酸酶活性的測定。

1.4.3 組織樣品采集與制備

采血后立即宰殺，采集胸肌、皮膚樣品后，打開腹腔，取肝臟、腎臟，并剔除上面的結(jié)締組織，各組織取樣量2.0 g左右，置于-20℃冰箱保存，用于各組織酪氨酸酶活性的測定。測定前取各組織塊約0.5 g在冰的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入5或10 mL的小燒杯內(nèi)。用移液管取9倍組織塊重量的預(yù)冷的0.86%冷生理鹽水于燒杯中，用眼科小剪刀盡快剪碎組織塊，最后用組織搗碎機(jī)(10 000 r/min)研磨制成10%組織勻漿，將制備好的10%組織勻漿用低溫低速離心機(jī)(2 000 r/min)離心約10 min，將離心好的勻漿留上清液(棄下面沉淀)置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 血清和組織酪氨酸酶活性的測定

酪氨酸酶活性的測定參照李洪武等[5]和鄧君等[6]的方法，并稍加改進(jìn):取 0.5 mL 5 mmol/L 的L-多巴于5 mL的EP管中，然后加入0.1 mol/L的磷酸緩沖液2.4 mL，37℃溫育10 min后，加入0.1 mL血清或組織勻漿液混勻，立即置于721型分光光度計(jì)475 nm處測定吸光度A值(A475)，連續(xù)讀數(shù)5 min，并記錄。以A475每分鐘增加或減少0.001為1個酶活力單位。

1.4.5 組織黑色素含量的測定

組織中黑色素含量參照Ozeki等[7]的方法，并稍加改進(jìn)，準(zhǔn)確稱取組織10 mg于玻璃管，加入90%的Soluene-350溶液10 mL，蓋上塞子后放入100℃的沸水中水浴，待組織完全溶解完、溶液呈黃色時，立即置于UV755B紫外可見分光光度計(jì)500 nm處測定吸光度A值(A500)，根據(jù)吸光度值比較組織樣品的黑色素含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有結(jié)果用Excel計(jì)算平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan氏法多重比較。

2 結(jié)果

2.1 飼糧銅添加水平對泰和烏骨雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，泰和烏骨雞平均日增重和平均日采食量隨飼糧銅添加水平的提高呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，料重比以30 mg/kg組最低，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)分析，以上指標(biāo)各組之間均無顯著差異(P＞0.05)。由此說明，在本試驗(yàn)的銅添加水平范圍內(nèi)，其飼糧水平的變化對1～28日齡泰和烏骨雞的生產(chǎn)性能無顯著影響。

表2 飼糧銅添加水平對1～28日齡泰和烏骨雞生產(chǎn)性能的影響Table2 Effects of dietary copper supplemental level on performance of Taihe silky fowls aged 1 to 28 days

2.2 飼糧銅添加水平對泰和烏骨雞血清和組織中酪氨酸酶活性的影響

由表3可知，飼糧中添加適量銅可顯著或極顯著影響1～28日齡泰和烏骨雞血清和組織器官中酪氨酸酶活性(P＜0.05或P＜0.01)，并呈現(xiàn)出隨飼糧銅添加水平的提高先升后降的趨勢，且以30 mg/kg組最高。

在血清酪氨酸酶活性方面，30 mg/kg組顯著高于0 mg/kg組(P＜0.05)，而其他各組之間差異不顯著(P＞0.05)。

在肝臟酪氨酸酶活性方面，30 mg/kg組極顯著高于其他各組(P＜0.01);5 mg/kg組與15 mg/kg組差異不顯著(P＞0.05)，但顯著高于0 mg/kg組、60 mg/kg組和125 mg/kg組，后3組之間也差異不顯著(P＞0.05)。

在腎臟酪氨酸酶活性方面，30 mg/kg極顯著高于0 mg/kg組、5 mg/kg組(P＜0.01)，顯著高于 125 mg/kg組(P＜0.05)，30 mg/kg組、15 mg/kg組與60 mg/kg組之間差異不顯著(P＞0.05)。

在皮膚、肌肉酪氨酸酶活性方面，30 mg/kg組極顯著或顯著高于其他各組(P＜0.01或P＜0.05)，而其他各組之間均差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 飼糧銅添加水平對泰和烏骨雞不同組織中黑色素含量的影響

由表4可知，飼糧中添加適量銅可顯著或極顯著影響1～28日齡泰和烏骨雞組織黑色素的含量(P＜0.05或P＜0.01)，并呈現(xiàn)組織黑色素含量隨飼糧銅添加水平的提高先升后降的變化趨勢。

在肝臟黑色素含量方面，30 mg/kg組極顯著高于 0 mg/kg組、5 mg/kg組和 125 mg/kg組(P＜0.01)，且后3組之間差異不顯著(P＞0.05)，而 30 mg/kg組與 15 mg/kg組、60 mg/kg組之間也均差異不顯著(P＞0.05)。

在皮膚、肌肉和腎臟黑色素含量方面，30 mg/kg組極顯著高于其他各組(P＜0.05)，其他各組之間均差異不顯著(P＞0.05)。

表3 飼糧銅添加水平對1～28日齡泰和烏骨雞血清和組織中酪氨酸酶活性的影響Table3 Effects of dietary copper supplemental level on the tyrosinase activity in serum and tissues of Taihe silky fowls aged 1 to 28 days U/mL

表4 飼糧銅添加水平對1～28日齡泰和烏骨雞不同組織中黑色素含量的影響(A500)Table4 Effects of dietary copper supplemental level on melanin content in different tissues of Taihe silky fowls aged 1 to 28 days(A500)

3 討論

銅是動物必需的微量元素。雞對銅的需要量因品種、生產(chǎn)目的、分析指標(biāo)和測定方法不同而各異。以不出現(xiàn)缺乏癥為標(biāo)準(zhǔn)，雞的銅需要量測定結(jié)果基本低于或等同于NRC(1999)推薦的需要量(8 mg/kg);以獲得最佳生產(chǎn)性能為目的的研究，大部分研究結(jié)果與NRC(1999)推薦的肉雞銅需要量8 mg/kg和Feedstuff的推薦標(biāo)準(zhǔn)11 mg/kg相近，由此可知，肉雞銅的需要量或者適宜供給量應(yīng)在10 mg/kg左右。夏中生等[8]的研究結(jié)果表明，添加56.5 mg/kg銅可提高正常狀態(tài)下0～3周齡肉雞的生長性能，獲得較理想的生長性能與飼料報(bào)酬。胡葉華[9]研究認(rèn)為，飼糧含銅25 mg/kg能改善蛋雞產(chǎn)蛋性能，75～150 mg/kg能顯著增加肉雞體增重。齊廣海等[10]報(bào)道，在玉米-豆粕-棉仁粕型基礎(chǔ)飼糧(含銅5～8 mg/kg)中添加6～30 mg/kg銅即能達(dá)到蛋雞的最佳生產(chǎn)性能和最佳飼料效率。然而，本試驗(yàn)結(jié)果表明，基礎(chǔ)飼糧(本底含量為4.75 mg/kg)中添加 0、5、15、30、60、125 mg/kg 銅，無論是平均日增重還是料重比，飼糧中銅不同添加水平均未對其產(chǎn)生顯著影響。吳覺文等[11]研究發(fā)現(xiàn)，高銅對肉雞后期有明顯的促生長作用，而在前期無效，與本試驗(yàn)結(jié)果相符。產(chǎn)生這些結(jié)果的原因可能與飼糧類型、銅攝入量、動物年齡及其他營養(yǎng)物質(zhì)水平高低有關(guān)。然而，適量的飼糧銅添加水平對泰和烏骨雞血清、肝臟、腎臟、皮膚及肌肉的黑色素含量、酪氨酸酶活性產(chǎn)生了顯著或極顯著的影響，并呈現(xiàn)出隨飼糧銅添加水平的提高先升后降的趨勢，其黑色素含量和酪氨酸酶活性在飼糧中添加30 mg/kg銅的組達(dá)到峰值。

酪氨酸酶是一個以銅離子(Cu2+)為輔基的金屬酶，其輔基Cu2+為該酶活性所必需，該酶分子中含有2個Cu2+的結(jié)合位置[4]。銅缺乏將導(dǎo)致動物酪氨酸酶的活性下降，從而使酪氨酸轉(zhuǎn)化為黑色素的過程受阻，黑色素的合成減少，導(dǎo)致皮膚與毛發(fā)色澤減退[12]。陳麗鳳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，Cu2+能夠上調(diào)酪氨酸酶活性，但Cu2+濃度超過一定范圍時，則抑制酪氨酸酶活性，且抑制作用隨Cu2+濃度的增加而增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加一定量的銅能夠提高烏骨雞體內(nèi)酪氨酸酶的活性。當(dāng)飼糧中銅的添加量為30 mg/kg時，血清、肝臟、皮膚、肌肉及腎臟中的酪氨酸酶活性達(dá)到最高，當(dāng)添加量高于30 mg/kg時，血清和組織中酪氨酸活性隨之下降。本試驗(yàn)結(jié)果與陳麗鳳等[13]的研究結(jié)果相符。相應(yīng)地，烏骨雞組織黑色素含量隨飼糧銅添加水平提高的變化趨勢與組織酪氨酸酶活性的變化趨勢相一致。酪氨酸酶是機(jī)體黑色素合成的關(guān)鍵酶和限速酶，其在體內(nèi)的表達(dá)量和活性決定著黑色素合成的速度和產(chǎn)量[2-3]。由此提示，在適宜銅添加水平內(nèi)，飼糧添加銅可通過提高血清和組織酪氨酸酶活性進(jìn)而提高組織黑色素的合成。

4 結(jié)論

①飼糧添加銅(5～125 mg/kg)對泰和烏骨雞生產(chǎn)性能無顯著影響。

②適宜銅添加水平范圍內(nèi)，飼糧添加銅可提高組織酪氨酸酶活性和黑色素含量。

③烏骨雞維持組織最佳黑色素沉積時，玉米-豆粕型飼糧適宜銅添加水平為30 mg/kg。

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