盧桂英，孫賀略，楊雪瀅，胡旭芳，馬志剛，曹秋娥

(云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院教育部自然資源藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650091)

正交試驗(yàn)優(yōu)化HPLC測(cè)定齊墩果酸與熊果酸的色譜條件

盧桂英，孫賀略，楊雪瀅，胡旭芳，馬志剛，曹秋娥

(云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院教育部自然資源藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650091)

為建立簡(jiǎn)單、快速的分離測(cè)定齊墩果酸與熊果酸的HPLC方法，實(shí)驗(yàn)采用L16(44)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，對(duì)HPLC分離測(cè)定齊墩果酸與熊果酸的主要影響因素(甲醇與水相的體積比、水相中乙酸和三乙胺的體積分?jǐn)?shù)以及流動(dòng)相流速)進(jìn)行了優(yōu)化.結(jié)果表明，以體積比為90∶10的甲醇與含有0.5%乙酸及0.01%三乙胺的水相混合溶液為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min，齊墩果酸和熊果酸可以在16 min內(nèi)得到有效分離，其工作曲線的線性范圍對(duì)于齊墩果酸為2.5～340.0 μg/ mL，對(duì)于熊果酸為5.0～340.0 μg/mL.將方法應(yīng)用于女貞子和山楂中齊墩果酸和熊果酸含量的測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%，加樣回收率均在95%～105%之間.

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì);高效液相色譜;齊墩果酸;熊果酸

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(orthogonal design)是利用正交表科學(xué)地安排與分析多因素試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，從而得出最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法之一，它能較全面地反映試驗(yàn)因素的影響情況，以相當(dāng)少的試驗(yàn)次數(shù)得到滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此在很多領(lǐng)域如光譜及色譜分析的樣品前處理、合成化學(xué)、植物有效成分提取等中都得到了廣泛應(yīng)用［1－3］，但采用該方法對(duì)高效液相色譜法(HPLC)分離測(cè)定齊墩果酸與熊果酸的條件進(jìn)行優(yōu)化的研究還未見報(bào)道.目前，用HPLC同時(shí)分析測(cè)定熊果酸與齊墩果酸這2個(gè)同分異構(gòu)體的研究已有不少報(bào)道［4－13］，但這些方法的分析時(shí)間大多數(shù)都超過了20 min［9－13］，其原因應(yīng)該是色譜條件沒有得到充分優(yōu)化.因此，本文采用了正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)HPLC分離測(cè)定熊果酸與齊墩果酸的條件進(jìn)行了優(yōu)化，并最終在16 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了熊果酸與齊墩果酸的有效分離與測(cè)定.與部分文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定這2個(gè)組分的HPLC方法相比［6－13］，本法的分析時(shí)間較短，而且其分離度好、線性范圍寬，能用于女貞子和山楂中熊果酸與齊墩果酸的準(zhǔn)確測(cè)定.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Waters1525－HPLC色譜儀(美國(guó)Waters公司)帶Waters 2996 PAD二極管陣列檢測(cè)器、Waters717 plus Autosampler自動(dòng)進(jìn)樣器、Waters C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)及Enpower中文色譜工作站.

熊果酸和齊墩果酸均購(gòu)于南京朗科醫(yī)藥有限公司，色譜純甲醇購(gòu)于美國(guó)Fisher公司，實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純，水為艾柯純水器UP級(jí)水.

1.2 溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備:熊果酸與齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液由甲醇配制.

樣品溶液的制備:準(zhǔn)確稱取干燥、粉粹過0.301 mm不銹鋼篩布的女貞子或山楂樣品1～3 g，加12 mL甲醇浸泡3 h，然后超聲提取30 min，過濾.殘?jiān)儆?2 mL甲醇重復(fù)提取1次.合并2次提取的濾液，用甲醇定容于25.0 mL容量瓶中，搖勻.提取液在用HPLC分析前用0.45 μm醋酸纖維濾膜過濾.

1.3 HPLC測(cè)定條件

色譜柱:Waters symmetry columns C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相∶體積比為90∶10的甲醇與含有0.5%乙酸及0.01%三乙胺的水相混合溶液;流速:0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:25℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化色譜分離條件

為了簡(jiǎn)化色譜條件的優(yōu)化過程，盡量得到理想的分離條件，實(shí)驗(yàn)采用了正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化色譜條件.初步實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，采用甲醇－水為流動(dòng)相時(shí)，在水相中加入少量乙酸和三乙胺對(duì)分離有改善作用.因此，實(shí)驗(yàn)采用了甲醇與水相的體積比(A)、水相中乙酸體積分?jǐn)?shù)(B)、水相中三乙胺體積分?jǐn)?shù)(C)、流動(dòng)相流速(D)4個(gè)因素，每個(gè)因素分別取4個(gè)水平(見表1)的L16(44)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并按照表2共進(jìn)行了16次實(shí)驗(yàn)，這16次實(shí)驗(yàn)測(cè)定得到的齊墩果酸和熊果酸的保留時(shí)間及分離度同樣列于表2中.

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平表

表2 HPLC條件優(yōu)化的L16(44)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

考慮到快速分析與有效分離的需要，實(shí)驗(yàn)分別選擇了分析時(shí)間(以后面出峰的熊果酸的保留時(shí)間表示)和兩組分的分離度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用極差分析法對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了分析，結(jié)果從表3可以看出，以分離度和分析時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到的分析結(jié)果是不一致的.在所試驗(yàn)的因素及其水平下，對(duì)分離度影響最大的是流動(dòng)相中甲醇與水相的體積比，最小的是水相中三乙胺的體積分?jǐn)?shù);對(duì)分析時(shí)間影響最大的也是流動(dòng)相中甲醇與水相的體積比，最小的是水相中乙酸的體積分?jǐn)?shù).以分離度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到的優(yōu)化方案是A1B4C1D4;以分析時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到的優(yōu)化方案是A4B3C2D1.

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由于按不同的評(píng)價(jià)指標(biāo)得到的優(yōu)化方案不一致，而一個(gè)好的HPLC方法，不僅要有足夠的分離度，還應(yīng)該有較短的分析時(shí)間，因此我們研究了各因素在不同水平下的分離度與分析時(shí)間的相關(guān)性，得到了如圖1所示的分離度與分析時(shí)間的關(guān)聯(lián)圖(1，2，3和4分別對(duì)應(yīng)每個(gè)因素的4個(gè)水平).據(jù)圖1的結(jié)果，在保證有效分離的前提下兼顧分析時(shí)間，綜合分析影響熊果酸和齊墩果酸分離效果的因素后，最終選定的優(yōu)化方案是:A3B3C1D2，即流動(dòng)相中甲醇與水相的體積比為90∶10，水相中乙酸和三乙胺的體積分?jǐn)?shù)分別為0.5%和0.01%，流動(dòng)相流速為0.8 mL/min，該方案對(duì)應(yīng)表2中的11號(hào)實(shí)驗(yàn).可見，在此色譜條件下，熊果酸和齊墩果酸在16 min內(nèi)得到了有效分離，分離度達(dá)到了1.425.

2.2 方法的工作曲線與精密度

在上述優(yōu)化得到的色譜條件(色譜柱:Waters C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:體積比為90∶10的甲醇與含有0.5%乙酸和0.01%三乙胺的水相混合溶劑;流速:0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:25℃，測(cè)定一系列不同質(zhì)量濃度的齊墩果酸與熊果酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積，以峰面積A對(duì)各組分的質(zhì)量濃度ρ繪制了工作曲線，得到齊墩果酸和熊果酸工作曲線的線性范圍分別為2.5～340.0 μg/mL與5.0～340.0 μg/mL，線性回歸方程分別為A=4 736.2 ρ/－5 878.4(r=0.998 9)與A=3 659.2 ρ/－17974.3(r=0.999 6).在相同條件下對(duì)質(zhì)量濃度均為100.0 μg/mL的齊墩果酸與熊果酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣11次，測(cè)得齊墩果酸的保留時(shí)間tR和峰面積A的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.21%和1.15%，熊果酸的保留時(shí)間tR和峰面積A的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.01%和0.98%.以3倍信噪比(S/N=3)確定了齊墩果酸與熊果酸的最低檢出限(LOD)分別為1.15 μg/mL和2.25 μg/mL.

2.3 女貞子和山楂中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定

將女貞子提取液和山楂提取液用0.45 μm醋酸纖維濾膜過濾后，在選定的色譜條件進(jìn)樣分析，樣品的色譜圖見圖2，圖中譜峰的定性識(shí)別采用標(biāo)準(zhǔn)加入法.樣品中齊墩果酸與熊果酸的含量測(cè)定結(jié)果和加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果從表4可見，在選定的色譜條件下，女貞子和山楂中的齊墩果酸與熊果酸彼此之間以及它們與樣品中的其它共存組分之間都得到了有效分離，而且定量測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和加標(biāo)回收率都滿足要求，說明通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化建立的此HPLC方法可以用于女貞子和山楂中齊墩果酸與熊果酸的分離分析.

表4 女貞子和山楂中齊墩果酸和熊果酸的含量(n=5)%

［1］方開泰，馬長(zhǎng)興.正交與均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:52－53.

［2］DEJAEGHER B，HEYDEN Y V.Experimental designs and their recent advances in set－up，data interpretation，and analytical applications［J］.J Pharm Biomed Anal，2011，56(2):141－149.

［3］付志玲，房敏峰，王啟林，等.烘法炮制苦杏仁工藝及影響因素研究［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，19(2):140－142.

［4］LI G L，ZHANG X L，YOU J M，et al.Highly sensitive and selective pre－column derivatization high－performance liquid chromatography approach for rapid determination of triterpenes oleanolic and ursolic acids and application to derivatization using response surface methodology［J］.Analytica Chimica Acta，2011，688(2/3/4):208－218.

［5］GBAGUIDI F，ACCROMBESSI G，MOUDACHIROU M，et al.HPLC quantification of two isomeric triterpenic acids isolated from Mitracarpus scaber and antimicrobial activity on Dermatophilus congolensis［J］.J Pharm Biomed Anal，2005，39(5):990－995.

［6］WANG H H，WANG Z Z，GUO W B.Comparative determination of ursolic acid and oleanolic acid of macrocarpium officinalis (Sieb et Zucc)Nakai by RP－HPLC［J］.Indust Crops Prod，2008，28(3):328－332.

［7］鄒盛勤，吳正平.高效液相色譜－二極管陣列檢測(cè)器法測(cè)定扛板歸不同部位中齊墩果酸和熊果酸的含量［J］.藥物分析雜志，2011，31(7):1381－1384.

［8］LEE M K，AHN Y M，LEE K R，et al.Development of a validated liquid chromatographic method for the quality control of prunellae spica:determination of triterpenic acids［J］.Anal Chim Acta，2009，633(2):271－277.

［9］梁泰剛，梁垿，趙承孝，等.RP－HPLC法測(cè)定東北地區(qū)不同產(chǎn)地滿山紅中齊墩果酸與熊果酸［J］.中草藥，2008，39 (8):1255－1257.

［10］劉玉軍，代龍，孫明江，等.HPLC法測(cè)定白芪龍膠囊中齊墩果酸和熊果酸［J］.中成藥，2011，33(6):994－996.

［11］石靜，聶晶，馮鈺锜.HPLC法測(cè)定女貞葉乙醇提取物中的齊墩果酸與熊果酸［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2010，25(3):210－214.

［12］張橋，沈娟，柳于介，等.高效液相色譜法測(cè)定中藥凌霄花中麥角甾苷、齊墩果酸和熊果酸含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36(8):1043－1045.

［13］董玉，賈鑫，馬強(qiáng).RP－HPLC法同時(shí)測(cè)定蒙藥復(fù)方菖蒲四味中熊果酸與齊墩果酸的含量［J］.中國(guó)藥房，2011，22 (43):4077－4078.

(責(zé)任編輯王琳)

Study on the Conditions of HPLC Method for the Separation and Determination of Oleanolic and Ursolic Acid in the Orthogonal Experiment

LU Gui-ying，SUN He-lue，YANG Xue-ying，HU Xu-fang，MA Zhi-gang，CAO Qiu-e
(Key Laboratory of Medicinal Chemistry for Natural Resources，Ministry of Education，School of Chemical Science and Technology，Yunnan University，Kunming 650091，China)

To develop a rapid and convenient method for the separation and determination of oleanolic acid(OA) and ursolic acid(UA)by HPLC，the main factors influencing HPLC，including the volumetric ratio of methanol and aqueous phase in the mobile phase，the percent of acetic acid and triethylamine in the aqueous phase，and the flow rate of the mobile phase，were optimized with the L16(44)orthogonal experimental design table.Ursolic acid and oleanolic acid could be separated and determined effectively within 15 min when a mixture of MeOH and aqueous solution consisting of 0.5%acetic acid and 0.01%triethylamine with the volumetric ratio of 90∶10 was employed as the mobile phase with a flow rate of 0.8 mL/min.The linear ranges were 2.5—340.0 μg/mL for oleanolic acid and 5.0—340.0 μg/mL for ursolic acid with good correlation.The method was applied satisfactorily for the determination of oleanolic acid and ursolic acid in Ligustrum lucidum Ait.and hawthorn with the relative standard deviation less than 2.0%，and the recovery rate ranging from 95%to 105%.

orthogonal experimental design;HPLC;oleanolic acid;ursolic acid

O 657.7

A

1672－8513(2012)04－0239－04

10.3969/j.issn.1672－8513.2012.04.002

2012－03－13.

云南省自然科學(xué)基金(2008CD066).

盧桂英(1981－)，女，碩士研究生，工程師.主要研究方向:色譜分析與柱材料研究.

曹秋娥(1967－)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師.主要研究方向:光譜、色譜與分離材料.