李萍萍，胡 瓊

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563099)

羊水過少使圍生兒發(fā)生率及死亡率明顯增 高，嚴重影響胎兒預后。胎膜與羊水的吸收及母體與羊水的物質(zhì)交換有密切的關(guān)系，羊膜作為其構(gòu)成的胎膜部分，在維持羊水的平衡中具有重要的作用。水通道蛋白(Aquaporin，AQP)，又叫水孔蛋白，是一組細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，可顯著增加細胞膜水通透性，在維持機體水平衡中起重要作用，與羊水的形成過程密切相關(guān)。其中，AQP9可在人胎盤和胎膜表達，提示AQP9可能對于維持羊水量穩(wěn)態(tài)平衡具有重要作用［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素對可影響水通道蛋白在水平衡中的作用，而糖皮質(zhì)激素在產(chǎn)科已廣泛應用，但對羊膜水通道蛋白的影響報道較少。羊水過少病因至今仍未明確，無法進行針對性治療，水通道蛋白的提出和胎膜中AQP9的檢出，可能使糖皮質(zhì)激素影響羊水形成機制的研究有新突破。因此，探討羊水正常與羊水過少產(chǎn)婦羊膜上皮細胞(hAECs)AQP9mRNA的表達及地塞米松對其表達的影響，可為臨床預防和治療羊水異常引起的高危妊娠提供新思路。

1 材料與方法

1.1 樣本納入標準 選取2011年7月至2012年7月在遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院行足月妊娠剖宮產(chǎn)分娩的羊水正常及羊水過少產(chǎn)婦各15例為研究對象，均為單胎，無藥物服用史，無其他妊娠合并癥及并發(fā)癥。依據(jù)羊水指數(shù)(AFI)和術(shù)中統(tǒng)計羊水量的標準分類［2］。具體標準如下:羊水正常樣本納入標準為產(chǎn)前最后一次B超檢查AFI為8～20 cm，術(shù)中羊水量為300～2 000 mL;羊水過少樣本納入標準為產(chǎn)前最后一次B超檢查AFI≤5 cm，術(shù)中羊水量＜300 mL。

1.2 樣本采集 分別無菌剝離羊水正常和羊水過少產(chǎn)婦胎盤娩出后的羊膜組織。

1.3 hAECs的原代、傳代培養(yǎng)及純化 剪碎羊膜，加入0.05%胰蛋白酶 －0.02%EDTA －2Na，于37°C水浴箱中消化30 min，用等體積含10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基終止消化，用300目不銹鋼篩網(wǎng)過濾并收集單細胞懸液，重復三次［3］。1 500 rpm離心10 min，用 LG－DMEM 培養(yǎng)基(含10%FBS、1% 非必需氨基酸、2 mmol/L L－谷氨酰胺、10 ng/mL EGF)重懸細胞，2%臺盼藍染色檢測細胞活力后，以5×105個/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中，在5%CO2，37℃，飽和濕度條件下培養(yǎng)，3d后換液，以后隔日換液。待細胞生長融合至80% ～90%時，用0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA－2Na消化并收集細胞，按1∶2～3傳代培養(yǎng)，同時用差異黏附法［4］純化細胞，以5×105個/mL濃度再接種培養(yǎng)，每2天換液1次，倒置顯微鏡下觀察生長情況。

1.4 培養(yǎng)細胞的鑒定 制備第3代hAECs細胞爬片，用PBS漂洗后經(jīng)4%多聚甲醛固定、0.3%Triton－X100破膜、正常羊血清封閉等過程后滴加鼠抗人CK19或鼠抗人波形蛋白單克隆抗體37°C孵育30 min，充分漂洗后，滴加鼠兔通用型二抗37°C孵育30 min，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片。陰性對照組加PBS替代一抗。

1.5 流式細胞儀檢測 收集新鮮分離的第三代hAECs，調(diào)整細胞密度1×106/mL，取細胞懸液200 μl，分別加入 10 μl熒光標記單抗:CD29 － PE、CD44－FITC、CD45－FITC、CD166－PE混勻，室溫避光孵育25 min，每管加2 mL含0.1%NaN3的PBS溶液，混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清，振蕩重懸細胞，每管加入200 μl含1%多聚甲醛的PBS溶液，混勻，4℃避光放置，24 h內(nèi)用流式細胞儀(BD公司)分析，每份樣品的采集細胞數(shù)≥20 000個，用Cell Quest軟件進行分析。同型對照為相應熒光素標記的小鼠IgG。

1.6 培養(yǎng)細胞分組 分別取羊水正常和羊水過少的第3代融合至80% ～90%生長良好的hAECs。根據(jù)地塞米松不同濃度分為5組:0 μg/mL組(對照組)、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組、40 μg/mL 組、100 μg/mL 組［5］，進行無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h 后，用于后續(xù)實驗。

1.7 hAECs AQP9 mRNA的檢測 經(jīng)地塞米松干預48 h后的hAECs用RNAiso Plus(大連寶生物)按試劑盒分別提取總RNA，嚴格按說明書進行操作。紫外分光光度計分別測總RNA樣品的濃度和OD260/OD280值。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物)操作說明進行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，再進行real－time RT－PCR擴增。AQP9引物(大連寶生物合成)序列:上游序列 5’TGCAACCGTCTTTGGCATTTA3’，下游序列5’CAAATGCGTTCGCCAGAGATA3’，擴增片段長度137 bp;GAPDH引物序列:上游序列5’GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3’，下游序列 5’TGGTGAAGACGCCAGTGGA3’，擴增片段長度138 bp。反應體系 20 μl，反應條件為:95℃ 3 min，95℃10s，61.4℃ 30 s，55℃ 10 s。計算 AQP9 mRNA 的相對表達量［6］。

1.8 統(tǒng)計學處理 所得實驗數(shù)據(jù)均采用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均值±標準差(±s)表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，不同濃度之間差異比較滿足正態(tài)性及方差齊性檢驗后采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 hAECs的分離、培養(yǎng)及純化結(jié)果 培養(yǎng)24 h后，有少量細胞貼壁呈圓形;第3天后貼壁的細胞數(shù)量迅速增多，形態(tài)多為三角形和卵圓形，其間混雜少量梭形細胞(見圖1 A)。經(jīng)差異黏附法純化，傳代6 h后即開始貼壁生長，24 h后細胞生長較快，培養(yǎng)3～4 d后細胞排列緊密，呈鋪路石樣外觀(見圖1B)?？梢娂毎饲逦?，位于胞質(zhì)中央，細胞質(zhì)均勻，核質(zhì)比大，透光度好。傳至6代后，細胞增殖速度明顯減緩，胞體體積變大。地塞米松干預前和干預后各實驗組細胞形態(tài)無差異。

圖1 hAECs培養(yǎng)形態(tài)(×200)

2.2 免疫細胞化學染色鑒定結(jié)果 免疫細胞化學染色檢測結(jié)果顯示，第3代培養(yǎng)細胞表達上皮標志的角蛋白CK19(見圖2A)，不表達波形蛋白(見圖2C)。

2.3 流式細胞儀分析結(jié)果 新鮮分離的第三代 hAECs高表達 CD29(99.61%)、CD166(97.11%)，低表達 CD44(14.67%)，不表達 CD45(見圖3)。

2.4 real－time RT－PCR 檢測 AQP9 mRNA 的表達 經(jīng)OD260nm/280nm值檢測樣本總RNA符合實驗要求。進行逆轉(zhuǎn)錄及real－time RT－PCR擴增后計算AQP9mRNA的相對表達量，其值見表1、2。結(jié)果顯示:羊水過少較羊水正常樣本AQP9mRNA表達量減低，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);經(jīng)不同濃度地塞米松干預后各組，與對照組比較，AQP9mRNA表達均增加，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);羊水正常樣本中地塞米松40μg/mL組的AQP9mRNA的表達量最高，羊水過少樣本中地塞米松20 μg/mL組AQP9 mRNA的表達量最高。

表1 羊水正常與羊水過少樣本的AQP9mRNA的相對表達量(n=15，±s)

表1 羊水正常與羊水過少樣本的AQP9mRNA的相對表達量(n=15，±s)

注:每組實驗重復3次，羊水過少樣本與羊水正常樣本比較，P ＜0.05。

檢測指標 羊水正常樣本 羊水過少樣本AQP9mRNA 141.16 ±23.72 72.64 ±11.72

表2 地塞米松干預后各樣本的AQP9mRNA的相對表達量(n=15，±s)

表2 地塞米松干預后各樣本的AQP9mRNA的相對表達量(n=15，±s)

注:每組實驗重復3次，*與0μg/mL組比較，P＜0.05。

樣 本 0 μg/mL組 10 μg/mL組 20 μg/mL組 40 μg/mL組 100 μg/mL組羊水正常 42.31 ±11.80 89.22 ±18.85* 117.56 ±15.70* 184.57 ±29.82* 124.78 ±20.66*羊水過少 51.91 ±5.54 129.06 ±26.94* 188.05 ±41.61* 118.37 ±24.52* 97.21 ±25.91*

3 討論

水通道蛋白(AQPs)因其可增加質(zhì)膜脂質(zhì)雙分子層的水通透性而得名，均為一類小分子膜蛋白。目前在哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白，即AQP0～AQP12［7］。近年研究發(fā)現(xiàn)胎膜上存在多種功能性的水通道蛋白，Beall MH［8］等通過對孕期鼠羊水量及羊水構(gòu)成的研究，發(fā)現(xiàn)羊水量可能與AQPs有關(guān)，AQPs可能通過調(diào)節(jié)胎盤膜內(nèi)水流最終改變羊水量，推測羊水膜內(nèi)吸收主要決定于AQPs［9］。胎盤是母胎液體交換的主要部位，但是，胎盤在液體平衡中的分子機制還未完全闡明。有人用數(shù)字模型對人的羊水動力學進行研究發(fā)現(xiàn)胎膜內(nèi)存在顯著的水及電解質(zhì)的流動［10］。由于胎兒血液循環(huán)中滲透壓(280mOsm/kg)，遠遠大于羊水滲透壓(255mOsm/kg)，故羊水膜內(nèi)轉(zhuǎn)運途徑是在滲透壓的作用下順滲透壓梯度從羊膜腔內(nèi)流至胎兒血循環(huán)，顯然，羊膜在其中發(fā)揮著重要作用。有人在長期插套管的胎綿羊體內(nèi)，觀察膜吸收在羊水容量調(diào)控中的作用［11］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水分子跨膜轉(zhuǎn)運的能力較強，不受流動速率的限制，羊水內(nèi)成分可調(diào)節(jié)短期膜內(nèi)流速，實際上最終還是滲透壓起決定性作用。因此，羊水膜內(nèi)吸收機制可能是通過改變滲透壓來調(diào)節(jié)跨膜水流動，從而改變羊水量。

Wang［1］等通過原位雜交顯示AQP9在羊膜上皮細胞、絨毛膜細胞滋養(yǎng)層及胎盤合體滋養(yǎng)細胞和細胞滋養(yǎng)細胞均有表達。目前，還發(fā)現(xiàn)胎膜中表達AQPl、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8 等，這些 AQP 是否參與了羊水膜內(nèi)平衡的調(diào)節(jié)呢?國內(nèi)外學者對其進行了探討:Zhu X［12］等發(fā)現(xiàn)特發(fā)性羊水過多產(chǎn)婦羊膜中的AQP8及羊膜和絨毛膜中的AQP9的表達均有很大程度的提高;郝榮增［13］等通過RTPCR研究發(fā)現(xiàn)，AQP1mRNA在羊水過少臨床病例胎膜組織表達顯著低于正常晚期妊娠胎膜組織;Shioji M［14］等用前列腺素F2α受體(FP)復制羊水過少鼠模型，通過免疫組化及蛋白印跡發(fā)現(xiàn)受孕20 d鼠AQP8蛋白較受孕14 d表達下降60%，表明過期妊娠導致羊水量減少可能與AQP8的減少有關(guān);我們通過比較羊水過少與羊水正常的表達差異發(fā)現(xiàn)羊水過少產(chǎn)婦hAECs AQP9mRNA表達量降低。因此，上述研究提示:AQP9在母胎液體交換中可能發(fā)揮重要作用，而且AQP9 mRNA在羊膜組織中的表達減少可能是羊水過少的病理分子機制之一，這在水代謝障礙疾病的病理認識和治療中具有重大意義。

糖皮質(zhì)激素有抗炎、免疫抑制和抗休克等廣泛的藥理活性［15］。產(chǎn)科主要用于產(chǎn)前促胎肺成熟。然而，目前地塞米松對羊膜上皮細胞AQP9表達的影響報道甚少。本實驗應用地塞米松干預，通過real－time RT－PCR觀察AQP9mRNA在羊水正常和羊水過少的hAECs的表達情況。結(jié)果顯示:不同濃度地塞米松干預前后各組的hAECs形態(tài)均無明顯差異，但其AQP9mRNA的表達量羊水過少樣本明顯低于羊水正常樣本，說明地塞米松能夠上調(diào)hAECs AQP9mRNA的表達，增強hAECs對羊水的轉(zhuǎn)運，且在一定范圍內(nèi)，存在劑量依賴關(guān)系。因此，我們推測地塞米松可通過影響AQP9的表達來影響其他小分子溶質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運，從而來改變羊水滲透壓導致羊水量的改變，但其具體機制尚需進一步研究。

綜上所述，AQP9在羊膜上皮細胞中的表達有重要作用。進一步研究AQP9的調(diào)節(jié)機制，對有羊水過少孕婦早期進行特異性干預，從而減少羊水過少并發(fā)癥的發(fā)生，降低圍產(chǎn)兒的病死率，達到優(yōu)生、優(yōu)育。

［1］Wang S，Chen J，Beall M，et al.Expression of aquaporin 9 in human chorioamniotic membranes and placenta［J］.Am J Obstet Gynecol，2004，191(6):2160 －2067.

［2］樂杰，謝幸，林仲秋，等.婦產(chǎn)科學［M］.第7版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2011.126 －129.

［3］方寧，張路，宋秀軍，等.人羊膜上皮細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定［J］.遵義醫(yī)學院學報，2009，32(2):121 －123.

［4］金玲，陳劍，吳靜，等.人羊膜上皮細胞的分離、純化及其生物學特性研究［J］.廣東醫(yī)學，2010，31(16):2055－2057.

［5］李燕、漆洪波.地塞米松對人羊膜上皮細胞Wish細胞株水通道蛋白8表達的影響［J］.中華婦幼臨床醫(yī)學雜志，2008，4(5):5 －7.

［6］劉森，王艷林，劉朝奇，等.PCR聚合酶鏈反應［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2009.94 －98.

［7］Zardoya R，Villalba S.A phylogenetic framework for the aquaporin family in eukaryotes［J］.J Mol Evol，2001，52(5):391－404.

［8］Beall M H，Wang S，Yang B et a1.Placental and membrane aquaporin water channels:correlation with amniotic fluid volume and composition ［J］.Placenta，2007，28(5－6):421－428.

［9］Feng X C，Ma T H.Water channel activity of plasma membrane affects chondrocyte migration and adhesion［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2008，35(1):7 －10.

［10］Papadopoulos M C，Saadoun S，Verkman A S.Aquaporins and cell migration［J］.Pflugers Arch，2008，456(4):693－700.

［11］Daneshmand S S，Cheung C Y，Brace R A.Regulation of amniotic fluid volume by intramembranous absorption in sheep:role of passive permeability and vascular endothelial growth factor［J］.Am J Obstet Gynecol，2003，188(3):786－793.

［12］Zhu X，Jiang S，Hu Y，Zheng X，et al.The expression of aquaporin 8 and aquaporin 9 in fetal membranes and placenta in term pregnancies complicated by idiopathic polyhydramnios［J］.Early Hum，2010，86(10):657 －720.

［13］郝榮增，劉慧姝，熊正方，等.水通道蛋白－1在人羊水過少胎盤和胎膜組織中的表達［J］.南方醫(yī)科大學學報，2009，2(6):1130 －1132.

［14］Shioji M，kuda H，anzaki T，et al.Reduction of aquaporin－8 on fetal membranes under oligohydramnios in mice lacking prostaglandin F2 alpha receptor［J］.J Obstet Gynaecol Res，2006，32(4):373 －378.

［15］楊寶峰，蘇定馮.藥理學［M］.第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007.361 －365.