劉建峰 龔永華劉華梅 馮建波

(1.湖北輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430070；2.武漢科諾生物科技股份有限公司，湖北武漢 430074)

豆粕是目前畜牧養(yǎng)殖業(yè)使用量很大的一種優(yōu)質(zhì)蛋白源。但豆粕中含有大量的蛋白原抗?fàn)I養(yǎng)因子，嚴(yán)重影響動(dòng)物對(duì)豆粕蛋白的消化、吸收，而通過(guò)將豆粕蛋白水解成豆粕多肽，可大大提高動(dòng)物對(duì)其吸收及利用率[1-2]，從而節(jié)約成本。多肽是經(jīng)過(guò)蛋白酶水解處理后得到的由3～10個(gè)氨基酸組成的小分子肽，其分子量一般為1 000 Da。因多肽具有溶解度好、黏度低、吸收好和促進(jìn)微生物發(fā)酵等特點(diǎn)，而成為豆粕發(fā)酵飼料研究的熱點(diǎn)[3-4]。目前，生產(chǎn)豆粕多肽飼料的方法主要有酸解法、酶解法、微生物發(fā)酵法。酸解法通過(guò)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的作用分解大分子蛋白為小分子肽，由于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿具有腐蝕性，會(huì)造成大量的污染；酶解法利用酶定向分解的特性將大分子蛋白分解為小分子肽，但酶解法生產(chǎn)的多肽苦味較重，適口性差；微生物發(fā)酵法是利用微生物的生化代謝功能將蛋白降解或轉(zhuǎn)化為多肽[5-6]。飼用多肽主要采用微生物發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)，從本質(zhì)上講，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)飼用多肽都是通過(guò)蛋白酶的酶解內(nèi)剪切作用而產(chǎn)生的[7]。發(fā)酵菌種主要是米曲霉、黑曲霉、乳酸菌、芽孢桿菌等能分泌豐富蛋白酶的菌種[8]。目前采用固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)豆粕多肽工藝的研究較多，但在生產(chǎn)應(yīng)用中大多數(shù)工藝較粗放，豆粕蛋白的水解程度較低（一般水解度只有4%），不能達(dá)到多肽（水解度需要達(dá)到10%以上）的水解效果。

為了解決這一問(wèn)題，本文尋求以現(xiàn)有發(fā)酵工藝（豆粕蛋白水解度為8%）的溫度為突破點(diǎn)，以蛋白水解度為檢測(cè)指標(biāo)，期望通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的溫度進(jìn)行分段調(diào)控，生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的豆粕多肽飼料產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

豆粕由東海糧油工業(yè)(張家港)有限公司提供，普通型豆粕粗蛋白含量≥44%；麥麩皮為市購(gòu)；糖蜜由南寧糖業(yè)股份有限公司提供；其它試劑均為化學(xué)分析純。

1.1.2 主要儀器

生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、高壓蒸汽不銹鋼滅菌鍋 (上海申安醫(yī)療器械廠)、SVS-1300型凈化工作臺(tái)(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

1.1.3 菌種

米曲霉F-112，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.4 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g、蔗糖2 g、自來(lái)水100 ml，pH值自然（約6.0），滅菌121℃、20 min。

麥麩培養(yǎng)基：麥麩90%、豆粕8%、葡萄糖2%，滅菌121℃、20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕85%、麥麩10%、糖蜜4%、稻草顆粒1%、自來(lái)水110%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的米曲霉菌種，接種到裝有適量固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的罐頭瓶（直徑10 cm、高10 cm）中，分別在 20、23、26、29、32、35 ℃培養(yǎng) 48 h，然后計(jì)數(shù)米曲霉的孢子數(shù)量。

1.2.2 菌株蛋白酶酶活最適溫度的測(cè)定

接種適量米曲霉到裝有適量固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的罐頭瓶中，培養(yǎng)65 h后終止培養(yǎng)，制成粗酶液，分別在 25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下測(cè)定 pH 值 6.0 的蛋白酶酶活。

1.2.3 菌株最適產(chǎn)蛋白酶溫度的測(cè)定

把試驗(yàn)1.2.1中一系列溫度下培養(yǎng)的米曲霉培養(yǎng)65 h后終止培養(yǎng)，然后在最適溫度下測(cè)定pH值6.0的蛋白酶的酶活。

1.2.4 發(fā)酵工藝溫度分段調(diào)控的響應(yīng)面法優(yōu)化

在原有固態(tài)發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，并根據(jù)試驗(yàn)1.2.1、1.2.2和1.2.3的試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert 8.0中混料（mixture）設(shè)計(jì)中的Optimal設(shè)計(jì)，對(duì)固態(tài)發(fā)酵工藝中的溫度進(jìn)行分段控制試驗(yàn)。

1.3 檢測(cè)方法

米曲霉孢子數(shù)量的測(cè)定采用GB 4789.15—2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)的方法；蛋白酶酶活的測(cè)定采用GB/T 23527—2009蛋白酶制劑的方法；水解度的測(cè)定采用甲醛滴定法[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株最適生長(zhǎng)溫度的確定

將米曲霉分別在 20、23、26、29、32、35 ℃溫度下培養(yǎng)48 h，然后計(jì)數(shù)米曲霉的孢子數(shù)量，其結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，曲線可以分為兩個(gè)階段，即第一階段，溫度從20℃到26℃，在此過(guò)程中，米曲霉的孢子數(shù)量逐漸增加，并達(dá)到最大值，即150億個(gè)/g；第二階段，溫度從26℃到35℃，在此過(guò)程中，米曲霉的孢子數(shù)量基本呈下降趨勢(shì)。從圖1曲線來(lái)看，米曲霉的最適生長(zhǎng)溫度在26℃左右。

2.2 菌株蛋白酶酶活最適溫度的確定

將米曲霉的純培養(yǎng)物，制成粗酶液，分別在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下測(cè)定 pH 值 6.0 的蛋白酶酶活，其結(jié)果見圖2。

從圖2中可以看出，米曲霉蛋白酶的最適酶活溫度在45℃左右。

2.3 米曲霉最適產(chǎn)蛋白酶溫度的確定

將米曲霉分別在 20、23、26、29、32、35 ℃下培養(yǎng)65 h，然后在45℃下測(cè)定pH值6.0的蛋白酶的酶活，其結(jié)果見圖3。

從圖3可以看出，米曲霉產(chǎn)蛋白酶的最適溫度在23℃左右，這與其生長(zhǎng)最適溫度（26℃左右）不同，說(shuō)明米曲霉在較高的溫度下生長(zhǎng)速度較快，而在較低的溫度下則更有利于產(chǎn)蛋白酶。

2.4 發(fā)酵工藝溫度分段調(diào)控的響應(yīng)面法優(yōu)化

2.4.1 溫度分段調(diào)控試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在原有固態(tài)發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，并根據(jù)2.1、2.2和2.3節(jié)的結(jié)果，應(yīng)用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert 8.0中混料（mixture）設(shè)計(jì)中的Optimal設(shè)計(jì)，進(jìn)行三段控溫的固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化，三段溫度控制依次為26℃、23℃和45℃，三段時(shí)間控制見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 三段時(shí)間控制目標(biāo)范圍

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.2 試驗(yàn)結(jié)果方差分析

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果以二次方模型為依據(jù)進(jìn)行方差分析(見表3),從表3可以看出,二次方模型的P值＜0.000 1,說(shuō)明模型是顯著的；在交互作用項(xiàng)中，AB、AC和BC都是顯著的；在二次方模型的失擬項(xiàng)中P值為0.604 4，大于0.05，說(shuō)明模型的失擬項(xiàng)不顯著，不需要對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行更高次方模型的模擬，即二次方模型是合適的。

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.4.3 二次方模型的建立

由表3試驗(yàn)結(jié)果方差分析可知，本試驗(yàn)結(jié)果分析采用的二次方模型是合適的，可以建立如下的二次方模型：HD=-1.255 67A-2.462 81B-3.374 12C+0.115 44AB+0.137 39AC+0.079 280BC。

為了驗(yàn)證所建立模型的擬合程度，進(jìn)行了模型的可信度分析(見表4)。

從表4模型的可信度分析中可以看出，校正復(fù)相關(guān)系數(shù)平方為0.854 0，說(shuō)明以試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)建立的模型，計(jì)算出的數(shù)據(jù)可以覆蓋85.4%的區(qū)域，即模型的擬合程度很好。

表4 模型的可信度分析

為了更形象地認(rèn)識(shí)A、B和C因素（不同溫度時(shí)間分段）對(duì)R1響應(yīng)值（水解度）的影響，可以建立等高線圖（見圖4）和響應(yīng)面圖（見圖5）。從圖4和圖5中可以看出，A、B和C 3個(gè)因素的重要性為C＞B＞A，如果A、B和C取值合適，則可以得到R1的最大值，且最大值在試驗(yàn)值設(shè)計(jì)覆蓋的范圍之內(nèi)。

3 預(yù)測(cè)和驗(yàn)證

為了得到R1響應(yīng)值的最大值，根據(jù)所建立的模型進(jìn)行了R1最大值的預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果有22組數(shù)據(jù)，根據(jù)工藝的可操作性和操作的難易程度，我們選取了5組（見表5），并進(jìn)行了試證試驗(yàn)。

表5 R1響應(yīng)值最大值的預(yù)測(cè)

考慮到試驗(yàn)的實(shí)際情況和操作的可能性，對(duì)上述的5組數(shù)據(jù)進(jìn)行了修正。在驗(yàn)證試驗(yàn)中，每一個(gè)處理做3個(gè)平行，試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 R1響應(yīng)值最大值預(yù)測(cè)的驗(yàn)證

4 結(jié)論

在豆粕發(fā)酵過(guò)程中，米曲霉經(jīng)歷了生長(zhǎng)、產(chǎn)酶和酶解的三個(gè)階段[10]，本文在原有發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，對(duì)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)豆粕多肽飼料的溫度分段調(diào)控進(jìn)行了研究。通過(guò)對(duì)米曲霉生長(zhǎng)溫度、產(chǎn)酶溫度和酶活溫度的試驗(yàn)，得到了最適生長(zhǎng)溫度（26℃）、最適產(chǎn)酶溫度（23℃）和最適酶活溫度（45℃）等參數(shù)。然后進(jìn)行了不同溫度的時(shí)間段的確定試驗(yàn)，即試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert 8.0中混料（mixture）設(shè)計(jì)中的Optimal優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到了最佳的時(shí)間段：0～33.5 h、26℃；33.5～50 h、23 ℃；50～65 h、45 ℃（見表 5）,并進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，較優(yōu)化前豆粕蛋白的水解度提高了140%，得到了較好的效果，基本達(dá)到了試驗(yàn)的目的。

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