王 佳 新, 張 麗 敏, 曹 方, 王 培 忠, 孫 玉 梅

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

隨著世界經(jīng)濟的高速發(fā)展,對石油及石油產(chǎn)品的需求日益增加,原油開采已成為世界各國的重要研究課題。原油主要由烷烴、芳烴、非烴、瀝青質(zhì)四種族分組成,原油在紫外區(qū)的吸收主要由芳烴族分引起[1],芳烴在255 nm具有特征吸收峰[2-3],故可用芳香烴量間接表征原油量[4]。在微生物采油過程中,原油中的芳香烴可能被一定程度分解[5-6],原油的芳香烴含量也可反映原油組分的變化。因此可通過原油中芳香烴的測量計算微生物采油的采收率以及探究原油組分變化。

目前芳烴含量的測定方法主要是氣相色譜法[7]、液相色譜法、紫外分光光度法[8]等。盡管氣相色譜法和液相色譜法可以很好地分離原油組分并精確測定各組分含量,但是這兩種方法對儀器、試劑、樣品及操作要求均較高,且成本較高[9]。與這兩種方法相比,紫外分光光度法具有快速、簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點[10],因此本文采用紫外分光光度法測定原油中芳烴含量,以表征原油采出量,并研究微生物采油發(fā)酵液成分對此方法測定結(jié)果的影響。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

儀器:752 N 紫外可見分光光度計,上海精密科學(xué)儀器有限公司；CR21G 冷凍高速離心機,日本日立；JY 99-2D 超聲波細(xì)胞粉碎機,寧波新芝科器研究所；PH-3C 精密pH計,上海雷磁儀器廠；HG303-4K 電熱恒溫培養(yǎng)箱,南京電器三廠制造。

試劑:環(huán)己烷,分析純,北京化工廠；葡萄糖,分析純,沈陽市新西試劑廠；硝酸鈉,分析純,華北地區(qū)特種化學(xué)試劑開發(fā)中心；磷酸二氫鉀,分析純,成都化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉,分析純,天津市天河化學(xué)試劑廠。

1.2 材 料

1.2.1 原 油

實驗所用的原油取自遼河油田。

1.2.2 菌 種

節(jié)桿菌屬ZY-1,微球?qū)賈Y-2,芽孢桿菌屬ZY-3、ZY-10、ZY-11、JY-6、JY-11以及JY-5均為本實驗室從遼河油田原油中篩選的耐高溫菌株。

1.2.3 培養(yǎng)基

原油復(fù)壯培養(yǎng)基(g/L):NaCl 3,NH4Cl 0.1,MgSO40.02,NaNO30.2,KH2PO40.1,K2HPO40.2,原油 10,蛋白胨 20,Tween 80 1,瓊脂 20。

斜面種子培養(yǎng)基(g/L):NaCl 5,牛肉膏 5,蛋白胨 10,瓊脂 20,pH 7.0[6]。不加瓊脂為液體種子培養(yǎng)基。

液狀石蠟發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):KH2PO43.4,NaH2PO41.5,NaNO34,MgSO4·7H2O 0.7,酵母粉 0.2,液蠟 17,pH 7.0[6]。

以上培養(yǎng)基均于121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞內(nèi)含物提取

菌種保存及活化:將實驗菌株于4 ℃冰箱保存,取保存菌株接于斜面種子培養(yǎng)基,于60 ℃活化培養(yǎng)24 h。

種子液制備:將2環(huán)斜面活化的菌體接入液體種子培養(yǎng)基中(100 mL三角瓶裝液量為50 mL),于60 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵液制備:在發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶裝液量為100 mL)接種體積分?jǐn)?shù)為5%種子培養(yǎng)液,于60 ℃靜置培養(yǎng)。

超聲破壁:

(1)分別取發(fā)酵液20 mL,移除發(fā)酵液上層油相,于4 ℃、10 000 r/min離心10 min,收集菌體沉淀,加20 mL去離子水,振蕩制成菌懸液,在600 nm處測吸光值OD600。

(2)將菌懸液在冰浴中進(jìn)行超聲破碎,超聲條件為400 W、超聲10 s、間歇10 s、總工作時間10 min。

(3)將超聲后的菌懸液于4 ℃、10 000 r/min離心20 min,取上清液。

1.3.2 原油標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

(1) 標(biāo)準(zhǔn)油儲備液:準(zhǔn)確稱取0.025 g原油,溶于環(huán)己烷,配制成每毫升含1 mg原油的混合液,貯于4 ℃冰箱待用。

(2) 用上述標(biāo)準(zhǔn)油儲備液分別配制質(zhì)量濃度為5、10、20、30、40 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)油使用液。以環(huán)己烷為空白,在255 nm測定吸光值OD255,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。

1.3.3 原油量的測定

影響原油量測定的成分選擇:①葡萄糖溶液(3、0.3、0.03 g/L)；硝酸鈉溶液(4、0.4、0.04 g/L)；磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉溶液(5、0.5、0.05 g/L),以及相應(yīng)濃度水平的3種成分的混合液。②pH 5,pH 3和pH 1的鹽酸溶液。③細(xì)胞內(nèi)含物提取上清液。

在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性區(qū)域選取一濃度,配制石油-環(huán)己烷溶液(即標(biāo)準(zhǔn)油使用液),分別與上述①,②,③溶液等體積充分混合,靜置分層1 h,以上層有機相為被測液,在255 nm測量吸光值OD255。以石油-環(huán)己烷溶液為空白,石油-環(huán)己烷溶液和水的混合液為對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 原油標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1可知,5～40 mg/L的石油-環(huán)己烷溶液在255 nm的吸光度呈良好的線性,R2=0.998 42。取質(zhì)量濃度為15 mg/L的石油-環(huán)己烷溶液進(jìn)行研究。

圖1 原油標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基對原油量測定的影響

如圖2所示,以發(fā)酵培養(yǎng)基中每一組分(葡萄糖、硝酸鈉、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉)及其混合的全組分作為影響因素,測定原油量的結(jié)果基本一致,說明培養(yǎng)基組分對原油量測定的影響差異很小。

圖2 發(fā)酵培養(yǎng)基的不同組分及質(zhì)量濃度條件下測定的原油量

Fig.2 Determination of crude oil in the presence of different components and different concentration of components in fermentation medium

不同質(zhì)量濃度發(fā)酵培養(yǎng)基組分的原油量測定結(jié)果基本一致,說明培養(yǎng)基組分及質(zhì)量濃度對原油量測定的影響差異很小,即在微生物采油過程中原油量的測定不受發(fā)酵培養(yǎng)基組分濃度變化的影響。

以上測定條件的測定結(jié)果與對照的原油量測定結(jié)果基本一致,但是與空白的原油量測定結(jié)果差異較大,因?qū)φ諡槭?環(huán)己烷溶液和水的混合液,空白為石油-環(huán)己烷溶液,前者只比后者多了水組分,所以作者認(rèn)為水是引起測定結(jié)果有差異的主要原因。

2.3 pH 對原油量測定的影響

如圖 3 所示,pH對原油量的測定基本沒有影響,即在微生物采油過程中原油量的測定不受pH變化的影響,與“2.2”所述同理,水是造成這些結(jié)果與空白有差異的主要原因。

圖3 不同pH條件下測定的原油量

2.4 水影響原油量測定的原因分析

由“2.2”和“2.3”的分析結(jié)果可知,水是造成各因素對原油量測定結(jié)果與空白有差異的主要原因。為了進(jìn)一步分析水影響待測液原油量測定的原因,采用靜止分離和離心分離待測液,并對兩種方法的測定結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果見圖 4。由圖4可知,靜止時間對原油量測定的結(jié)果有明顯的影響。靜止分離0～1 h,水對原油量測定的影響較大,隨著靜止分離時間的延長,試樣與空白的原油量測定結(jié)果有接近趨勢；當(dāng)靜止分離不少于1 h時,二者的測定結(jié)果基本一致。說明靜止分離時間越長,分離效果越好,水對原油量的測定影響越小。靜止分離1 h即可獲得較好的分離效果,樣品與空白的原油量測定結(jié)果基本一致。采用離心分離,試樣與空白的原油量測定結(jié)果差異很小。

綜上分析,試樣的充分分離可消除水對原油量測定的影響。與靜止分離相比,離心分離具有穩(wěn)定、快速、分離效果好等優(yōu)點,但實驗操作較繁瑣、設(shè)備要求較高,因此,采用靜止分離1 h較經(jīng)濟適用。

圖4 不同的樣品分離方法測定的原油量

Fig.4 Determination of crude oil by different separation methods of sample

2.5 發(fā)酵液中采油微生物細(xì)胞內(nèi)含物對原油量測定的影響

2.5.1 實驗菌株的生長測定

將實驗菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng),不同培養(yǎng)階段的菌體生長狀態(tài)測定結(jié)果見圖 5。

圖5 實驗菌株的生長狀態(tài)

由圖5可知,各實驗菌株培養(yǎng)3～7 d的菌體密度均有明顯上升,表明各菌株生長良好。

2.5.2 不同培養(yǎng)時間細(xì)胞內(nèi)含物對原油量測定的影響

在微生物采油過程中,采油微生物會發(fā)生自溶,細(xì)胞內(nèi)含物會進(jìn)入發(fā)酵液中,而細(xì)胞內(nèi)含物種類較多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜,為了研究細(xì)胞內(nèi)含物對原油量測定的影響,測定不同生長狀態(tài)的細(xì)胞內(nèi)含物存在時的試樣原油量,結(jié)果見圖6。

圖6 不同生長狀態(tài)的細(xì)胞內(nèi)含物存在時測定的原油量

Fig.6 Determination of crude oil in the presence of cellular contents at different growth state

由圖6可知,有不同生長狀態(tài)的細(xì)胞內(nèi)含物參與的試樣與對照的原油測定量差異很小,因此,可以忽略細(xì)胞內(nèi)含物對原油量測定的影響。

3 結(jié) 論

(1)采用紫外分光光度法測定原油量,操作簡單、快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定可行。適用范圍至少可以在5～40 mg/L,此范圍之外有待進(jìn)一步研究。

(2)培養(yǎng)基各組分、pH以及實驗菌株細(xì)胞內(nèi)含物對此方法測定原油量影響較小,水是影響測定的主要原因。

(3)采用1 h以上的靜止分離和離心分離均能使被測樣品達(dá)到較好的分離效果,可使樣品中水分得以徹底分離,消除水對此方法測定原油量的影響。

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