馮曉丹，王 晶，顧平清，唐家琪

豬鏈球菌2型（Streptococcus suis 2，S．suis 2）是一種重要的人獸共患病病原體［1］。S．suis 2感染可致豬急性敗血癥、腦膜炎、關節(jié)炎、心內膜炎及急性死亡，并且可通過傷口和呼吸道等傳播途徑感染人類，造成發(fā)病和死亡［2］。1998年和2005年我國江蘇省和四川省分別暴發(fā)大規(guī)模S．suis 2感染疫情，患者出現鏈球菌中毒性休克綜合征（Streptococcal toxic shock syndr o me，STSS），病情兇險，病死率高（62．7%～81．3%），具體致病機制尚不明確［3］。

二 元 信 號 轉 導 系 統(tǒng) （Two－co mponent signal transduction systems，TCSTSs）是廣泛存在于細菌中的調控單元，由細胞膜上的組氨酸激酶（Histidine kinase，HK）和細胞內的反應調節(jié)因子（Response regulator，RR）兩部分組成，在病原菌感染宿主的過程中能調控多種毒力因子的表達以完成其致病過程［4］。我實驗室已針對 TCSTSs與S．suis 2致病的關系進行了初步的研究。李明等［5］利用基因敲除技術證實位于89 kb毒力島上的TCSTS Sal KR在S．suis 2致病過程中發(fā)揮重要作用，動物實驗結果顯示，基因敲除株對仔豬不致病。對孤因子Cov R的研究顯示，該蛋白對S．suis 2的不同毒力因子進行全局負調控；仔豬攻毒實驗證實，該蛋白編碼基因失活后菌株毒力增強［6］。為研究TCSTS Cia RH在S．suis 2致病過程中所起的作用，我們之前對cia R基因進行敲除，并比較了敲除株和野生株在生物學及致病方面的差異，結果顯示，敲除株的生長速度減緩，抗氧化能力減弱，耐酸能力下降，但動物實驗顯示敲除株對小鼠的毒力沒有發(fā)生明顯改變［7］。

針對病原菌TCSTSs的研究目前主要集中在其調控的基因上，對于TCSTSs本身的結構特征關注較少，而相似的結構特征可能具有相似的信號感受方式及調控模式。為深入了解S．suis 2 Cia RH感受信號及調控基因的方式，本研究利用生物信息學方法分析其組分蛋白的結構域。同時，利用PCR及序列分析手段評估Cia RH在不同血清型S．suis中的分布情況。

1 材料和方法

1．1 菌株 31個S．suis血清型標準株由加拿大蒙特利爾大學 Marecelo Gottschalk教授惠贈；另外的9株2型S．suis包括：T15（cps2＋sl y＋）來自荷蘭，S735（cps2＋mr p＋epf＋sl y＋）來自加拿大，SS2－N（cps2＋mr p＋sl y＋）來自德國，98012（cps2＋mr p＋epf＋sl y＋）、Habb （cps2＋mr p＋epf＋sl y＋）、HA68（cps2＋ep f＋）及98 T003（cps2＋mr p＋ep f＋sl y＋）為中國江蘇分離菌株，266及05ZYH33（cps2＋mr p＋ep f＋sl y＋）為中國四川省資陽市分離菌株。

1．2 試劑及儀器 Taq DNA聚合酶為Ta Ka Ra公司產品；1 kb DNA分子量標準為Fer mentas公司產品；PCR擴增儀為HYBAID公司產品。

1．3 Cia RH生物信息學分析 使用NCBI網站的BLASTN獲得S．suis 2 Cia RH編碼基因cia H 及cia R同源核酸序列；BLASTP獲得其組分Cia H及Cia R 同 源 蛋 白 氨 基 酸 序 列 （http：／／blast．ncbi．nl m．nih．gov／）。多序列比對使用 Cl ustal X2［8］進行，利用 Genedoc（http：／／www．psc．edu／biomed／genedoc）修飾并輸出比對后的序列。序列進化樹使用MEGA5中的NJ法構建［9］。分別使用Signal P4．0［10］和 T MH MM 2．0（http：／／www．cbs．dt u．dk／services／T MH MM／）在線對 Cia RH 組分蛋白的氨基酸序列進行信號肽和跨膜區(qū)預測。利用Batch CD－Search工具［11］預測 Cia RH 組分蛋白的結構域。蛋白二級結構預測使用PSIPRED v3．0在線軟件（http：／／bioinf．cs．ucl．ac．uk／psipred／）。

1．4 PCR方法檢測cia R基因在豬鏈球菌不同血清型中的分布 以S．suis 2強毒株05ZYH33為模板，設計cia R 基因的上下游引物，cia1：5′－GCCGGATCCATGATGATTAAAATATTG－3′； cia2：5′－CGCAAGCTTTTAGGCATTTTTTAGAAT－3′。引物由上海賽百盛基因技術有限公司合成。PCR反應條件為：95 ℃，5 min；94 ℃，30 s；52 ℃，40 s；72℃，1 min。共反應30個循環(huán)。電泳檢測擴增產物。

2 結 果

2．1 Cia RH 的一般特性 在S．suis 2強毒株05ZYH33中，Cia RH的 HK蛋白Cia H （Gen Bank accession No．YP＿001198460．1）基因長度為1 380 bp，GC含量為36．67%，蛋白長度為459 aa，預測的分子質量為52．0 k D。RR蛋白Cia R（Gen Bank accession No．YP＿001198461．1）基因長度為675 bp，GC含量為35．71%，蛋白長度為224aa，預測的分子質量為25．4 k D。兩個基因在S．suis 2染色體上位置毗鄰，且有8 bp的重疊，這與TCSTSs編碼基因的結構特征相符。

2．2 Cia RH同源蛋白比對 利用 NCBI網站BLASTP進行同源檢索，結果顯示，S．suis 2 Cia RH的同源蛋白在鏈球菌屬不同菌種中廣泛分布。其中，Cia R與變形鏈球菌UA159（S．mutans UA159）、肺炎鏈球菌R6（S．pneu moniae R6）、無乳鏈球菌2603 V／R（S．agal actiae 2603 V／R）及化膿鏈球菌 M1 GAS（S．p yogenes M1 GAS）同源蛋白的氨基酸序列一致性（identity）依次為90%、88%、87%及82%；相比之下，Cia H與這些菌株的同源蛋白相似性較低，一致性分別為48%、49%、47%及49%。將S．suis 2 Cia H及Cia R與其各自同源蛋白進行多序列比對，結果顯示，不同菌種Cia H的保守區(qū)域主要集中在后半部分（C－端），前半部分（N－端）保守型較低（圖1）；而Cia R的全長序列均較為保守（圖2）。與其他菌種的Cia R序列相比，S．pneumoniae同源序列在N－端明顯多出約20個氨基酸的序列，這可能是由于在蛋白編碼框預測時選擇了不同的起始密碼子所致。

圖1 Cia H及其同源蛋白氨基酸序列比對Fig．1 Align ment of amino acid sequence of Cia H with its orthologs The amino acid sequences of Cia H were derived from SSU （S．suis 05ZYH33），SMU （S．mutans UA159），SPN（S．pneumoniae R6），SAG （S．agal actiae 2603 V／R），and SPY （S．pyogenes M1 GAS）．

圖2 Cia R及其同源蛋白氨基酸序列比對Fig．2 Alignment of amino acid sequence of Cia R with its orthologs The amino acid sequences of Cia R were derived from SSU （S．suis 05ZYH33），SMU （S．mutans UA159），SPN （S．pneu moniae R6），SAG （S．agal actiae 2603 V／R），and SPY （S．pyogenes M1 GAS）．

2．3 Cia RH蛋白組分結構預測 信號肽預測結果顯示，Cia H及Cia R蛋白均不含信號肽序列。Cia H的N－端含有兩個跨膜區(qū)，中間存在168個氨基酸的間隔（38aa～205aa），推測為胞外的信號感應區(qū)（Sensor）。結構域分析結果顯示，Cia H的胞內（C－端）含有HK中高度保守的信號傳遞（Transmitter）結構域 His KA及 HATPase＿C；Cia R蛋白N－端為保守的磷酸受體（Receiver）結構域REC，C－端為具有DNA結合功能的效應（Effector）結構域trans＿reg＿C（圖3）。Cia H可能的胞外感應區(qū)未發(fā)現保守的結構域。為了解其可能的結構，我們選取該區(qū)的168aa進行二級結構預測。結果顯示，該區(qū)域的兩端存在長短不一的α－螺旋結構，中間區(qū)域存在5個β－折疊，其余部分為無規(guī)卷曲（圖4）。根據Cia H同源蛋白序列比對結果（圖1）找出S．mutans UA159、S．pneu moniae R6、S．agal actiae 2603 V／R及S．p yogenes M1 GAS在168aa對應區(qū)域的序列并進行二級結構預測。有意思的是，雖然這些氨基酸序列相互之間同源性較低，但卻具有相似的二級結構（結果未顯示）。推測這些菌株的Cia RH可能具有空間結構保守的胞外信號感受結構域。

圖3 S．suis 2 Cia RH組分蛋白結構示意圖Fig．3 Schematic diagram of S．suis 2 Cia RH component proteins

圖4 S．suis 2 Cia H信號感應區(qū)（38aa～205aa）二級結構預測Fig．4 Secondary str ucture prediction of Cia H sensor（38aa－205aa）in S．suis 2

2．4 Cia RH在S．suis多種血清型中的分布 考慮到Cia R序列更為保守，我們設計了cia R基因的上下游引物：cia1和cia2，并以不同血清型S．suis的菌液為模板，進行PCR擴增。結果顯示，選取的10株2型S．suis菌株中，除了T15菌株，均能擴增出目的條帶；30株其他血清型中有17株擴增出目的條帶（圖5）。

圖5 PCR方法檢測cia R基因在S．suis多種血清型中的分布Fig．5 Distribution of gene cia R in different serotypes of S．suis by PCR detection 1：S．suis 1／2；2：S．suis 1；3：S．suis 2；4：S．suis 3；5：S．suis 4；6：S．suis 5；7：S．suis 7；8：S．suis 8；9：S．suis 9；10：S．suis 10；11：S．suis 11；12：S．suis 13；13：S．suis 15；14：S．suis 16；15：S．suis 17；16：S．suis 18；17：S．suis 19；18：S．suis 20；19：S．suis 21；20：S．suis 21；21：S．suis 23；22：S．suis 25；23：S．suis 26；24：S．suis 27；25：S．suis 28；26：S．suis 29；27：S．suis 30；28：S．suis 31；29：S．suis 32；30：S．suis 33；31：S．suis 34；32：05ZYH33；33：Negative control；34：266；35：T15；36：98012；37：HA68；38：Habb；39：S735；40：98T003；41：SS2－N；M：1 kb DNA ladder mar ker．

使用NCBI網站BLASTN分別對S．suis不同血清型Cia RH的編碼基因cia R和cia H 進行同源序列比對。結果顯示，S．suis 2 cia R基因與其他血清型序列一致性為94%～100%，cia H序列一致性為93%～100%。針對cia R的進化關系分析顯示，不同血清型來源的序列通常位于不同的分支上，1／2型、14型與2型聚集在一起，而2型菌株GZ1的序列卻與D12發(fā)生聚集，位于距離05ZYH33最遠的分支上（圖6）。推測2型S．suis T15菌株未能擴增出目的片段是由于該菌株所含的cia R基因與05ZYH33的cia R基因序列同源性較低。其他13株不同血清型未能擴增出目的條帶，可能也是由于相同的原因。綜合PCR檢測及S．suis不同血清型已知序列分析結果，推測Cia RH在S．suis的不同血清型中廣泛存在，不同菌株之間的DNA序列存在不同程度的差異。

圖6 S．suis不同血清型cia R基因序列進化樹Fig．6 Phylogenetic tree of cia R gene sequences in differentserotypes of S．suis

3 討 論

TCSTSs是細菌中感受并處理環(huán)境信號的主要方式［12］。一般的TCSTSs都包括4個基本的功能模塊：位于HKs上的信號感受區(qū)（Sensor）及信號傳遞區(qū)（Trans mitter）和位于RRs上的信號接收區(qū)（Receiver）及調節(jié)／效應區(qū)（Regulat or／Eff ector）。信號感受區(qū)用于感受特定的環(huán)境信號，在此基礎上，HKs上的信號傳遞區(qū)保守的組氨酸殘基發(fā)生ATP依賴的自體磷酸化。這個磷酸基團緊接著被轉移到對應的RRs信號接收區(qū)保守的天冬氨酸殘基上，并使效應區(qū)活化，發(fā)揮調節(jié)作用［13］。

本研究發(fā)現在豬鏈球菌2型05ZYH33 Cia H的N－端存在兩個跨膜區(qū)，中間存在168aa的間隔區(qū)，可能為胞外的信號感受區(qū)，但未能找到保守的結構域。通過二級結構預測發(fā)現，該區(qū)域可能含有一個混合α－螺旋／β－折疊型（又稱作PDC）結構域，且可能分布于不同的鏈球菌屬細菌的Cia H中［14］。近期的一個研究結果也顯示，這種結構域在不同細菌HKs的胞外感應區(qū)廣泛分布［15］。由于該類型初級序列的高度多變，普通結構域分析方法無法檢出，使其存在被嚴重低估。因其與PAS結構域在空間結構上的相似性，又被稱作PAS樣結構域（PAS－like do main）。含有該類型結構域的代表型HKs包括Pho Q、Dcu S及Cit A，它們依次感受環(huán)境中的二價離子、C4－雙羧酸及檸檬酸成分。針對肺炎鏈球菌的Cia RH的研究結果顯示，該系統(tǒng)可能直接或間接感受Ca2＋信號［16］。以上結果提示，S．suis 2 Cia RH可能也通過含有PBC型結構域的胞外信號感受區(qū)與環(huán)境中的離子或其他小分子成分結合，產生調節(jié)效應。

PCR檢測及Cia RH編碼基因同源序列分析結果提示，該TCSTS在豬鏈球菌不同血清型中廣泛分布，且相互間存在不同程度的序列差異。該系統(tǒng)可能參與S．suis的正常生理及代謝過程，同時，也可能在致病性S．suis感染宿主的特定階段起到調控作用。我們下一步將針對Cia RH具體感受的信號、調控的靶基因及其在S．suis 2感染宿主不同階段的作用進行更加深入的研究。

（在序列分析及文章的寫作過程中得到中科院微生物研究所程功博士的幫助，特表示感謝?。?/p>

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