王光祥，尚佑軍，呂占祿，張克山，田 宏，劉湘濤

羊口瘡（Orf）是由羊口瘡病毒（Orf vir us，ORFV）引起反芻動物，主要以引起綿羊和山羊感染為主的一種急性、高度接觸性人獸共患傳染?。?－2］。ORFV主要感染羔羊和幼羊，主要以口唇、舌、鼻等部位形成丘疹、水皰、膿皰和痂皮為特征，羔羊常因繼發(fā)感染而死亡，給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經濟損失，并對人類健康構成威脅［2－5］。

ORFV屬于痘病毒科副痘病毒屬，病毒粒子長220～250 n m，寬125～200 n m，表面結構為管狀條索斜形交叉“8”字形纏繞線團狀。ORFV基因組為線性雙股DNA，全長130～150 kb，病毒基因組中間是一個長的中心編碼區(qū)，兩頭是相同的反向末端重復序列［6－7］?，F(xiàn)在大多數(shù)學者公認CPDV有16個開放性閱讀框架（ORF），130個基因，在127個雙股線性基因中，有88個基因是高度保守的。可變區(qū)大多數(shù)位于基因的末端，中間基因相對保守［6－8］。包括末端基因區(qū)和中間核心區(qū)。F1L基因位于病毒基因組中部，其編碼產生的39 k Da蛋白是病毒表面微管的組成成分之一，并且能誘導宿主產生中和抗體［9］。此外，該蛋白具有肝素結合活性，能夠與表達于大多數(shù)哺乳動物細胞表面的硫酸乙酰肝素（Heparansulfate，HS）受體結合，因此該蛋白被認為在病毒吸附和侵入過程中起到重要作用［10］。Gallina等［11］研究證實F1L蛋白能夠刺激機體中和抗體的產生，同時也能介導細胞免疫，因而該蛋白被認為是刺激機體產生免疫應答的主要免疫原蛋白，同時也被認為是ORFV亞單位疫苗研制的候選抗原。因此，研究F1L蛋白對羊口瘡的診斷和免疫具有重要意義。

現(xiàn)代生物信息學的迅猛發(fā)展，為我們提供了一種高效、快速預測表位的方法，但以往表位預測多采用單參數(shù)預測，有其局限性，隨著生物信息學的發(fā)展及其網絡數(shù)據(jù)庫的擴展，多參數(shù)綜合預測已成為當前表位預測的主流［12］，可大大提高預測的準確性。本研究以ORFV F1L靶抗原，預測其二級結構、信號肽、優(yōu)勢的B細胞表位和T細胞表位為ORFV后續(xù)的診斷和免疫研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 氨基酸序列 選取ORFV F1L蛋白全長共340個氨基酸（氨基酸序列來自本實驗室測序），序列如下：MDPPEITAYIIGVAEGRGTKEVFPTLP YLVGLADDPPKPQPAPAPSPAPAPAPAPAPS PAPAPAPKPSPPAPHPKGDHVLKAVEWKDV DSKDYPHFFTDMCKSTCPKEMQRRAAH HLN L WESISAGTVSTKYSDNDFILVVDNDMTFRKP EMVKPLIEA MKTNGWY MAQLKETY MTGAL ATNVPGTGDPEL MVYPGGYDVSLDAYITNV GGMKKLYDAIIKDGGLRGGLLTEVFTLEKRL SLARVVLSGAEQVVYPEYYIQVKTRLGGAP SL WSLLAT WLARF WPGAIYFLTTPLFSFMG LFDVDVVDVFILAYLLVLVLLLPNSRLL WFIA GLLVTAIV。

1．2 方法 應用生物信息學相關軟件和生物信息學網站，分析ORFV F1L蛋白的功能基序、表位類型、功能定位、信號肽二級結構等；所用生物信息學網站有：蛋白二級結構預測網站：http：／／npsapbil．ibcp．fr／cgi－bin／npsa＿auto mat．pl？page＝／；信號肽預測網站：http：／／www．cbs．dt u．dk／ser v－ices／Signal P／；B細胞表位預測網站：http：／／www．i mtech．res．in／raghava／abcpred；細胞毒性 T 細胞（CTL）表位預測網站http：／／www．i mtech．res．in／raghava／nhlapred；輔助T細胞（Th）抗原表位的預測網站：http：／／www．i mtech．res．in／raghava／pr opred／；生物信息學軟件有：DNAStar Laser gene7程序包的Pr otean軟件，在線軟件Signal P 4．0。

2 結 果

2．1 ORFV F1L蛋白的二級結構 用SOPMA［13］服務器預測ORFV F1L蛋白的二級結構結果如圖1所示，ORFV F1L蛋白的二級結構主要包括α－螺旋、β－轉角、無規(guī)則卷曲和β－片層4種類型，分別為α－螺旋34．71%、β－片層18．82%、β－轉角5．88%%、無規(guī)則卷曲40．59%。整個結構中α－螺旋區(qū)域和無規(guī)則卷曲區(qū)域出現(xiàn)的較多，這有利于維持病毒膜蛋白的穩(wěn)定性。β轉角及無規(guī)則卷曲是比較松散的柔性結構，該區(qū)域常含有B細胞的優(yōu)勢表位［14］。F1L蛋白的無規(guī)則卷曲和β轉角即功能區(qū)主要位于第1—5、14—27、33—77、86—93、104—106、125—136、143—149、162—165、177—190、195—201、222—229、248—150、255—258、264—265、267—269、282—287、292—294、300—304、322—326位氨基酸（圖1）。

圖1 ORFV F1L蛋白二級結構預測結果h：α－螺旋，t：β－轉角，c：無規(guī)則卷曲，e：β－片層Fig．1 Secondary structure prediction oforFV F1L protein h：Alpha helix；t：Beta turn；c：Random coil；e：Extended strand．

2．2 ORFV F1L蛋白信號肽預測 使用在線軟件Signal P 4．0，利 用 神 經 網 絡 法 （Neural net wor k，NN）［14］預測ORFV F1L蛋白序列中是否存在潛在的信號肽。在線軟件Signal P 4．0預測結果顯示ORFV F1L蛋白沒有信號肽，預測結果如圖2。

圖2 F1L蛋白信號肽預測結果Fig．2 The signal peptide analysis of F1L

2．3 ORFV F1L蛋白B細胞表位多參數(shù)預測 使用DNAStar Lasergene7程序包的Protean軟件提供的模塊對ORFV F1L蛋白進行多參數(shù)預測，選擇Kyte－Doolittle法預測蛋白的親水性；Emini法預測蛋白的表面可及性；用Karplus－Eisenberg法分析蛋白的柔韌性；用Jameson－Wolf法預測蛋白的抗原指數(shù)見圖3。將ORFV F1L蛋白單參數(shù)預測結果進行綜合分析后發(fā)現(xiàn)，同時有3種或以上參數(shù)預測的表位肽段：1—4、16—19、34—49、55—78、129—134、143—152、169—174、186—188、210—214位氨基酸可能存在的B細胞表位（表1）。最后將單參數(shù)預測綜合分析結果采用ABCpred［13］方案（窗口長度16，閾值0．51）進行篩選、驗證，發(fā)現(xiàn)ORFV F1L蛋白的 9—24、30—45、54—69、128—143、136—151、167—182和207—222等區(qū)段可能存在優(yōu)勢B細胞表位（表2）。

表1 不同方案預測ORFV F1L蛋白B細胞表位的肽段位置Tab．1 B cell epitopes for ORFV F1Lpredicted by various methods

表2 ABCpred方案預測初篩肽段的結果Tab．2 The score of the peptides obtained by preliminary prediction with ABCpred program

圖3 F1L親水性分析Fig．3 Hydrophilicity analysis of F1L

圖4 F1L表面可及性區(qū)域Fig．4 Surface probability regions of F1L

圖5 F1L柔韌性區(qū)域Fig．5 Flexible regions of F1L

圖6 F1L抗原指數(shù)分析Fig．6 Antigenic index of F1L

2．3 ORFV F1L蛋白T細胞表位預測

2．3．1 ORFV F1L蛋白CTL表位預測 在網絡平臺輸入ORFV F1L蛋白序列，運用ANNs＋QM法（神經網絡＋量化矩陣法）［16］分別預測 HLA－A2、HLA－A＊0201、HLA－A＊0202、HLA－A＊0203、HLA－A＊0205的分子結合肽，閾值設為0．5，結果見表3所示。綜合分析ORFV F1L 228—236位的GLLTEVFTL，310—318 位 的 FILAYLLVL 為ORFV F1L蛋白的CTL表位。

表3 CTL抗原表位預測Tab．3 Prediction for CTL epitopes oforFV F1L

2．3．2 ORFV F1L蛋白Th表位的預測 使用在線程序，對ORFV F1L蛋白的Th表位進行預測［17］，預測 DRB1＿0101、DRB1＿0102 、DRB1＿0301 3種不同類型，預測結果見表5。綜合分析0RFV F1L的51段3類結合肽，有3段結合肽為3類結合肽等位基因所共有，即317—325位的 VLIQTTAEA、318—326位的 VLLLPNSRL和308—316位的VFILAYLLV為ORFV F1L的Th表位。

3 討 論

本研究借助于計算機網絡技術和生物學軟件對ORFV F1L蛋白的二級結構，信號肽和潛在的T、B淋巴細胞抗原表位進行了預測和分析。分析結果表明該蛋白形成α螺旋結構的能力較強，β折疊較少，這可能與該蛋白的氨基酸組成有關。蛋白二級結構中的α－螺旋、β折疊的化學鍵能較高，能較牢固地維持蛋白的高級結構，但很難較好地與抗體嵌合，且經常處于蛋白質內部，因而很少成為抗原表位。但是該蛋白具有較多的β轉角和無規(guī)則卷曲結構單元，這些結構易于扭曲、盤旋并展示在蛋白表面，有利于抗體嵌合，常含有B細胞優(yōu)勢抗原表位［15，18］。

信號肽為分泌蛋白在通過膜時N末端所含作為信號的氨基酸序列，常由15～25個氨基酸構成，N端含少量的堿性氨基酸，主要含不攜帶電荷的疏水性氨基酸，在蛋白成熟后信號肽序列將被剪切、去掉。通過預測信號肽可以避免預測出的表位落在信號肽區(qū)，預測結果顯示ORFV F1L蛋白沒有信號肽。

目前，已有幾十種預測B細胞抗原表位的算法，其中，親水性、可及性、柔韌性及抗原性方案的預測效果相對較好［18］。基于人工神經網絡算法的ABCpred方案，預測準確率最高可達65．9%［15］。本文綜合這些方法對ORFV F1L蛋白潛在的B細胞抗原表位進行預測和分析。ABCpred方案預測ORFV F1L蛋白中的B細胞表位分值的范圍在0．66～0．84之間，用單參數(shù)和二級結構篩選出的肽段在用該方法的預測結果中均可找到相對應的片段。本研究推測ORFV F1L蛋白最可能的B細胞優(yōu)勢抗原表位分別位于其N端氨基酸殘基第9—24、30—45、54—69、128—143、136—151、167—182和207—222等區(qū)段。

表4 Th表位的預測Tab．4 Prediction for Th cell epitopes oforFV F1L

CTL表位是經抗原提呈細胞處理提呈的一種抗原蛋白，它與MHC－I類分子結合，被T細胞抗原受體（TCR）特異性識別從而誘導相應的CTL發(fā)生免疫應答的短肽，它一般含8～10個連續(xù)氨基酸，活化并決定了CTL特異性殺傷效應［16，19］。預測CTL表位，常用結合基序法、人工神經網絡法和蛋白酶體矩陣法，本研究采用最為高效、準確的人工神經網絡法結合量化矩陣法，選擇HLA－A2、HLA－A＊0201、HLA－A＊0202、HLA－A＊0203、HLA－A＊0205 5類31段結合肽，來綜合預測ORFV F1L蛋白的CTL表位。結果顯示ORFV F1L蛋白的228—236位的 GLLTEVFTL，310—318位的FILAYLLVL兩段結合肽為各類所共同預測。該肽段可與MHCI類分子結合形成復合物呈遞給免疫細胞，進而調控激活CTL細胞的細胞毒作用。

Th表位是識別外源蛋白（如細菌、病毒抗原和免疫接種的蛋白等）經加工后與MHC II類分子結合的抗原表位（外源性抗原T細胞表位）。外源蛋白被APC捕獲送入溶酶體裂解成一定肽段后，在HLA－DM分子幫助下，消除由Ii鏈引導進入溶酶體的MHCII類分子上的Ⅱ類分子Ii鏈相關肽（CLIP），使得肽段中的T細胞表位進入MHC II類分子凹槽與之結合形成抗原肽－MHC II類分子復合體，再易位至APC表面，被CD4＋Th細胞識別，激活Th細胞以輔助B細胞產生抗體?；罨募毎€產生一些細胞因子，介導NK細胞等免疫細胞產生細胞免疫應答。MHC－Ⅱ類分子呈異源雙體，包括α、β兩條鏈，分別有α1、α2和β1、β2結構域，其中α1和β1組成與兩端開放的抗原肽結合深槽。MHC－Ⅱ類分子結合槽底部呈微小鋸齒形排列，形成9個“小袋”樣結構，可與相應結合肽上的氨基酸結合［20］。相對應的結合肽兩端的氨基、羧基可有一定的延長，從13～34個氨基酸不等。本研究利用MHC－II類分子結合肽在線程序，預測了ORFV F1L蛋白的DRB1＿0101、DRB1＿0102、DRB1＿03013種不同等位基因的Th表位。預測結果顯示0RFV F1L的51段3類結合肽，有3段結合肽為3類結合肽等位基因所共有，即317—325位的 VLIQTTAEA、318—326位的 VLLLPNSRL和308—316位的VFILAYLLV氨基酸短肽。它們可與MHCII類分子結合，被抗原遞呈細胞轉運至細胞表面與T細胞受體識別結合，起到協(xié)調體液免疫和細胞免疫應答的作用。［17，20］。

本研究依靠生物信息學網絡平臺和生物軟件分析了ORFV F1L的二級結構，預測了B細胞抗原、HLA抗原肽、MHC結合肽等。為該蛋白的體外表達及用于ORFV的免疫診斷和疫苗研制提供理論依據(jù)。

［1］Yin Z，Liu JH．animal vir ology ［M］．Beijing：Science Press，1997：977－980．（in Chinese）殷震，劉景華．動物病毒學［M］．北京：科學出版社，1997：977－980．

［2］Weber O，Siegling A，F(xiàn)riebe A．Inactivated parapoxvir us ovis（Orf vir us）has antiviral activity againsthepatitis B vir us and her pes si mplex vir us［J］．J Gen Vir ol，2003，84（7）：1843－1852．DOI：10．1099／vir．0．19138－0

［3］Br uce T，Catherine S，Mc Caughan A，etal．Analysis of an orf vir us chemokine binding pr otein：Shifting ligand specificities among a fa mily of poxvir us vir oceptors［J］．PNAS，2003，100（25）：15137－15142．DOI：10．1073／pnas．2336648100

［4］Mazur C，Machado RD．Detection of contagious pustular der matitis vir us of goats in a severe outbreak［J］．Vet Rec，1989，125：419－420．DOI：10．1136／vr．125．16．419

［5］Zhang JQ，Wu JY．Survey on a case zoonotic orf［J］．Chin J Vet Med，2006，42（9）：53－54．（in Chinese）張家確，吳景央．一起人畜共患羊傳染性膿皰病的調查［J］．中國獸醫(yī)雜志，2006，42（9）：53－54．

［6］Robinson AJ，Ellis G，Balassu T．The geno me oforf vir us：restriction endonuclease analysis of viral DNA isolated from lesions oforf in sheep［J］．Arch Virol，1982，71（1）：43－55．DOI：10．1007／BF01315174

［7］Cottone R，Bütt ner M，Bauer B，etal．Analysis of geno mic rearrangement and subsequent gene deletion of the attenuated Orf vir us strain D1701［J］．Vir us Res，1998，56：53－67．DOI：10．1016／S0168－1702（98）00056－2

［8］Delhon G，Tul man ER，Afonso CL，etal．Geno mes of the parapoxvir uses orf vir us and bovine popular st o matitis vir us［J］．J Vir ol，2004，78（1）：168－177．DOI：10．1128／JVI．78．1．168－177．2004

［9］Zhao K，He WQ，Gao F．The research progress oforf vir us［J］．China Ani m Husbandry and Vet，2008，35（11）：133－136．（in Chinese）趙魁，賀文琦，高豐．羊傳染性膿皰皮炎病毒研究進展［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2008，35（11）：133－136．

［10］Scagliarini A，Gallina L，Dal Pozzo F，etal．Heparin binding activity oforf vir us F1L pr otein［J］．Vir us Res，2004，105（2）：107－112．DOI：10．1016／j．vir usres．2004．04．018

［11］Gallina L，Scagliarini A，Ciulli S，etal．Prosperi cloning and expression of the Orf vir us F1L gene，Possible Use as a subunit vaccine［J］．Vet Res Co mmun，2004，28（Suppl 1）：291－293．DOI：10．1007／s00705－002－0850－2

［12］Liliana F，Bjar ni H，Oliver K，etal．Epitope prediction algorit h ms for peptide－based vaccine design［J］．Proc Co mputational Sys Bioinfor matics，2003，33：7690－7695．DOI：10．1109／CSB．2003．1227293

［13］Geourjon C，Deleage G．SOPMA：significant i mpr ove ments in pr otein secondar y str uct ure prediction by consensus prediction from multiple align ments［J］．Co mput Appl Biosci，1995，11（6）：681－684．DOI：10．1093／bioinfor matics／11．6．681

［14］Petersen TN，Br unak S，von Heijne G，etal．Signal P 4．0：discri minating signal peptides from trans membrane regions［J］．Nat Met hods，2011，8（10）：785－786．DOI：10．1038／n met h．1701

［15］Saha S，Raghava GP．Prediction of continuous B－cell epitopes in an antigen using recurrent neural net wor k［J］．Proteins，2006，65（1）：40－48．DOI：10．1002／prot．21078

［16］Bhasin M，Raghava GP．Prediction of CTL epitopes using QM，SV M and ANN techniques［J］．Vaccine，2004，22（23／24）：3195－3201．DOI：10．1016／j．vaccine．2004．02．005

［17］Al－Attiyah R，Mttstafa AS．Co mputer－assisted prediction of HLA－DR binding and experi mental analysis for hu man pro miscuous Thl－cell pepfides in the 24 k Da secreted lipopr otein （Lpp X）of Mycobacteriu m t uberculosis［J］．Stand J Immunol，2004，59（1）：16－24．DOI：10．2115／fiber．61．85

［18］Liu AD，Yang Y，Li FH，etal．Prediction of B cell epitopes and HLA estricted CTL epit opes of hu man er vical cancer oncogene protein［J］．J Fourt h Militar y Med Univ，2007，28（14）：1260－1263．（in Chinese）劉安定，楊燕，李方和．人宮頸癌基因蛋白B細胞表位及其HLA限制性T細胞表位預測析［J］．第四軍醫(yī)大學學報，2007，28（14）：1260－1263．

［19］Tang XD，F(xiàn)ang DC，Wan Y，etal．Research pr ogress on the CTL epitope prediction［J］．J Clin Med Pract，2008，12（1）：31－37．（in Chinese）湯旭東，房殿春，萬瑛，等．CTL表位預測的研究進展［J］．實用臨床醫(yī)藥雜志，2008，l2（1）：31－37．

［20］Yang YL，Chu J，Guo XK，etal．Cloning and expression of the gene frag ment encoding for epitope of outer membrane protein Omp L1 from Leptospira［J］．Chin J Zoonoses，2005，21（1）：27－31．（in Chinese）楊榆玲，褚嘉祐，郭曉奎，等．鉤端螺旋體Omp L1抗原表位預測、克隆和表達［J］．中國人獸共患病雜志，2005，21（1）：27－31．