田雷瑜，曹筠嵩，劉忞之，楊燕，王偉

藥用蛋白和工業(yè)生物催化劑通常天然含量很低，需要異源重組和表達(dá)制備，這需要發(fā)展一個(gè)穩(wěn)定的、易操作的和純化工藝可放大的高效生物表達(dá)系統(tǒng)。釀酒酵母細(xì)胞相對(duì)于大腸桿菌和哺乳動(dòng)物具有高效的胞外分泌特點(diǎn)和易于遺傳操作的整合型或附加體型的表達(dá)載體，其已被廣泛用于重組蛋白的生物表達(dá)系統(tǒng)[1-2]。

酵母細(xì)胞自身外泌并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面或發(fā)酵液中的蛋白可分為兩大類，一類蛋白是經(jīng)過經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑（ER-Golgi）分泌的，這類外泌蛋白的前體通常含有信號(hào)肽，翻譯后首先被定向地轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；另一類不含有信號(hào)肽的胞質(zhì)蛋白如糖代謝酶、伴侶蛋白和翻譯起始因子等也可以經(jīng)過非經(jīng)典的 ER-Golgi 非依賴分泌途徑分泌到胞外，其外泌的分子機(jī)制還沒有闡明[3]。許多外泌蛋白和胞內(nèi)膜蛋白在合成時(shí)都依賴于其 N-端的信號(hào)肽功能元件，細(xì)胞內(nèi)膜定位的蛋白盡管也經(jīng)過ER-Golgi 途徑轉(zhuǎn)運(yùn)，但是其信號(hào)肽的下游和分子內(nèi)部存在穿膜肽或 C-膜定位信號(hào)（如核定位信號(hào)肽）控制蛋白的亞細(xì)胞轉(zhuǎn)位[4]。分泌型的信號(hào)肽含有三個(gè)區(qū)域：N-、H- 和C- 區(qū)；N- 區(qū)含有堿性正電荷的極性氨基酸殘基，H- 區(qū)含有 7 ～ 15 個(gè)疏水氨基酸殘基（如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸）形成的 α-螺旋，跨越 ER 膜，促進(jìn)新生肽的轉(zhuǎn)位，它是信號(hào)肽的主要功能區(qū)；分泌肽的 C-區(qū)含有極性結(jié)構(gòu)，作為信號(hào)肽酶 I 的識(shí)別剪切位點(diǎn)，其中小的和中性氨基酸殘基（如丙氨酸和甘氨酸）位于剪切位點(diǎn)的 -3和 -1[5-6]。到目前為止，無論是在釀酒酵母還是在甲醇酵母的蛋白質(zhì)工程研究中所使用最多的信號(hào)肽是釀酒酵母的交配型 α-因子的信號(hào)肽功能元件（85-aa prepro 區(qū)）[1]，其次是釀酒酵母的蔗糖水解酶的信號(hào)肽[7]。α-因子的信號(hào)肽功能元件不僅含有一個(gè)靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)且由信號(hào)肽酶剪切的19 個(gè)氨基酸殘基信號(hào)肽，還含有一個(gè) 66 個(gè)氨基酸殘基的前導(dǎo)區(qū)[8-9]。因此由 α-因子引導(dǎo)的異源蛋白分泌表達(dá)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)由信號(hào)肽酶剪切后，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出芽并轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入高爾基體；然后在高爾基體腔內(nèi)再由內(nèi)肽酶 Kex2 剪切 2 個(gè)保守的堿性氨基酸殘基（Lys-Arg 或 Arg-Arg）的羧基端肽鍵釋放前導(dǎo)區(qū)，最后再包裝成囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面。因此，在蛋白的分泌過程中，如果沒有前導(dǎo)區(qū)的作用，可能會(huì)導(dǎo)致融合蛋白積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；而其他信號(hào)肽（僅含有 pre 區(qū)）與 α-因子的前導(dǎo)區(qū)融合形成具有 α-因子野生型相似的功能元件，促進(jìn)融合蛋白的外泌?？梢?α-因子的前導(dǎo)區(qū)在由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)位過程中起到非常重要的作用[8]。

目前，除 α-因子信號(hào)肽外，還有很多研究報(bào)道了釀酒酵母和甲醇酵母自身分泌蛋白的信號(hào)肽應(yīng)用于異源蛋白的生物表達(dá)，如具有 α-因子信號(hào)肽相似結(jié)構(gòu)的釀酒酵母 PIR 家族的細(xì)胞壁蛋白 CIS3和 HSP150 等多個(gè)信號(hào)肽用于人白細(xì)胞介素-2、脂肪酶、小鼠的唾液酸轉(zhuǎn)移酶等多個(gè)蛋白的外泌表達(dá)[10]。Massahi 和 ?al?k[11]系統(tǒng)地研究了甲醇酵母5 個(gè)信號(hào)肽對(duì)人生長(zhǎng)激素表達(dá)的影響；此外，還有研究報(bào)道了異源的信號(hào)肽如菊粉酶的信號(hào)肽引導(dǎo)人皮質(zhì)素蛋白在釀酒酵母中的分泌表達(dá)[12]。但綜合分析這些研究結(jié)果，很容易地發(fā)現(xiàn)釀酒酵母的α-因子信號(hào)肽依然是促進(jìn)融合蛋白分泌表達(dá)的活性較好的功能元件[1]。為進(jìn)一步從釀酒酵母中研究發(fā)現(xiàn)具有更好促分泌活性的信號(hào)肽功能元件，本研究基于釀酒外泌蛋白質(zhì)組的研究結(jié)果，采用生物信息學(xué)手段進(jìn)行計(jì)算分析，確定了 16 個(gè)定位于細(xì)胞壁的外泌蛋白信號(hào)肽元件，選取其中編碼外切β-(1,3)-葡聚糖酶 1（exo-1,3-beta-glucanase 1，EXG1）的信號(hào)肽元件為研究目標(biāo)，以 α-因子信號(hào)肽的促分泌活性作對(duì)比分析，結(jié)果表明 EXG1 的信號(hào)肽功能元件具有較好的促分泌活性。

表 1 本研究使用的 PCR 擴(kuò)增引物Table 1 PCR primers used in this study

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Escherichia coliTrans1-T1 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，用于質(zhì)粒載體的構(gòu)建；本實(shí)驗(yàn)室保存的釀酒酵母 W303-1b/ΔES（E表示EXG1 基因敲除，S表示SPR1基因敲除）[13]為宿主進(jìn)行酵母的轉(zhuǎn)化和融合蛋白的外泌表達(dá)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 以釀酒酵母外泌蛋白質(zhì)組（245 個(gè)外泌蛋白）為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[14]，利用 Uniprot（http://www.uniprot.org/uniprot/?query=&sort=score）數(shù)據(jù)庫(kù)下載每個(gè)蛋白的氨基酸殘基序列；Phobius軟件[15]（http://phobius.sbc.su.se）能夠很好地區(qū)分膜蛋白的穿膜螺旋和信號(hào)中疏水區(qū)，但其預(yù)測(cè)信號(hào)肽的敏感性和精確性稍差，因此先利用此軟件對(duì)每個(gè)外泌蛋白是否具有信號(hào)肽進(jìn)行初步計(jì)算篩選；然后利用 SignalP4.1[16]（http://www.cbs.dtu.dk/services/Signa）lP/對(duì)經(jīng) Phobius 計(jì)算初選的含有信號(hào)肽蛋白進(jìn)行更精確的計(jì)算分析，閾值設(shè)定為 0.5，計(jì)算得分值越高含有信號(hào)肽的可信度也越高；最后再分別利用 PSORT II[17]（https://psort.hgc.jp/form2.html）和 ProP1.0[18]（http://www.cbs.dtu. dk/services/ProP/）對(duì)上述篩選獲得的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位和是否含有高爾基體蛋白酶 Kex2 的加工剪切位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，再利用 NetNGlyc1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析。

1.2.2 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.2.1 含有EXG1 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 以酵母基因組 DNA 為模板，以PDB ID 1H4P 的核酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成引物（表 1），經(jīng) PCR 擴(kuò)增獲得編碼EXG1的 DNA 片段，然后插入到表達(dá)載體 pδGAPh，該載體 pδGAPh 含有釀酒酵母三磷酸甘油醛脫氫酶（GAP）基因啟動(dòng)子、釀酒酵母δ 整合位點(diǎn)、釀酒酵母終止子磷酸甘油酸激酶 1（PGK1）和可利用潮霉素 B（HygB）進(jìn)行篩選的HygB 激酶標(biāo)記基因，經(jīng) CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Trans1-T1，篩選獲得陽(yáng)性克隆，即得到酵母整合表達(dá)質(zhì)粒 pδGAPh-EXG1。

1.2.2.2 含有 α-Factor 信號(hào)肽元件融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建 以 pPIC9K（invitrogen）質(zhì)粒為模板，利用 A_F1/A_F2 引物對(duì)（表 1）經(jīng) PCR 擴(kuò)增獲得 α-Factor 的信號(hào)肽功能元件，然后與 A_F3/A_F4引物對(duì)（表 1）所擴(kuò)增的 EXG1 DNA 片段進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)，最后再以 A_F1/A_F4 引物對(duì)擴(kuò)融合DNA 片段，利用限制性內(nèi)切酶NdeI 和EcoR I定向置換 EXG1 自身所對(duì)應(yīng)的 DNA片段，即得到 pδGAPh-α-Factor-EXG1。

1.2.3 酵母轉(zhuǎn)化 參照文獻(xiàn)[19]報(bào)道的方法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞和 DNA 轉(zhuǎn)化，把轉(zhuǎn)化體系涂布于含有相應(yīng)抗生素的 YPD 平板上篩選，在 30 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 3 d。將獲得的菌株轉(zhuǎn)接于含高濃度抗生素的篩選平板上進(jìn)行高拷貝整合陽(yáng)性克隆復(fù)篩。

1.2.4 陽(yáng)性克隆的鑒定 目的基因轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，篩選獲得陽(yáng)性克隆，然后采用酵母基因組 DNA提取試劑盒提取基因組 DNA。通過 PCR 鑒定確定目的基因是否整合進(jìn)入宿主的基因組中，最后再以各基因的特異引物對(duì)純化的 PCR 擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.5 菌體生物量測(cè)定 測(cè)定OD600光密度值：取 1 ml 發(fā)酵液，稀釋一定倍數(shù)至OD600值在 0.2 ～0.8 之間，測(cè)定其OD600值，通過計(jì)算得到菌體生物量。

1.2.6 重組菌株外泌蛋白酶的活性測(cè)定 采用4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）法測(cè)定 EXG1酶活[20]。配置不同濃度的對(duì)硝基苯酚，于 400 nm處測(cè)定吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活定義：每分鐘釋放 1 nmol 的對(duì)硝基苯酚所需要的細(xì)胞干重（mg）。挑取單克隆于 10 ml 液體 YPD 培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min 培養(yǎng) 15 ～ 20 h，以起始OD600= 0.2 轉(zhuǎn)接到 50 ml 液體 YPD 培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng) 24 h 后取適量發(fā)酵液置于滅菌的 1.5 ml EP管中，8000 r/min 離心 3 min，收集上清液。取上清液 50 μl，加入 50 μl 的 20 mmol/LpNPG（溶于 pH 6.0 的醋酸鈉緩沖液中），混勻，30 ℃ 反應(yīng)15 min，立即加入 100 μl 的 10%（W/V）Na2CO3終止反應(yīng)，反應(yīng)過程中釋放出對(duì)硝基苯酚，利用PerkinElmer 酶標(biāo)儀于 400 nm 測(cè)定吸光值。

2 結(jié)果

2.1 釀酒酵母外泌蛋白質(zhì)組的生物信息學(xué)分析

2.1.1 外泌蛋白信號(hào)肽的計(jì)算確定 釀酒酵母與哺乳動(dòng)物細(xì)胞一樣具有依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體分泌的經(jīng)典和非經(jīng)典的分泌途徑[3]，外泌蛋白如果經(jīng)過經(jīng)典途徑分泌，則發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)信號(hào)肽酶或高爾基體腔內(nèi)切蛋白酶 Kex2 的剪切，導(dǎo)致外泌蛋白質(zhì)組的質(zhì)譜分析檢測(cè)不到信號(hào)肽的整個(gè)功能元件區(qū)。因此，本研究利用 Uniprot 對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的245 個(gè)外泌蛋白所對(duì)應(yīng)全長(zhǎng)氨基酸殘基序列進(jìn)行下載整理，這些蛋白質(zhì)氨基酸序列首先利用計(jì)算程序 Phobius 預(yù)測(cè)分泌信號(hào)肽和信號(hào)肽酶的剪切位點(diǎn)，然后再利用計(jì)算程序 SignalP4.1和 PSORT II進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)計(jì)算分析總計(jì)獲得 65 個(gè)含有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的外泌蛋白，其中含有 prepro 區(qū)的蛋白16 個(gè)（表 2），僅含有信號(hào)肽 pre 區(qū)的外泌蛋白49 個(gè)，計(jì)算程序 Phobius 和 PSORT II 預(yù)測(cè)的不同剪切位點(diǎn)在表 2 中已標(biāo)注。

表 2 釀酒酵母含有 prepro 區(qū)的信號(hào)肽Table 2 List of endogenous and exogenous signal peptides with prepro-region for Saccharomyces cerevisiae

續(xù)表 2

續(xù)表 2

圖 1 外泌蛋白信號(hào)肽酶剪切位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)分析（P1 表示信號(hào)肽酶剪切位點(diǎn)-1）Figure 1 Statistical sequence analysis of predicted signal peptidase cleavage sites (P1 of the logos corresponds to the position -1 of signal peptidase cleavage site in the substrate)

2.1.2 信號(hào)肽酶剪切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu) 針對(duì) 65 個(gè)信號(hào)肽功能元件的計(jì)算分析結(jié)果可以看出，分泌型的信號(hào)肽含有明確的 N-、H- 和 C- 區(qū)，圖 1 是對(duì)信號(hào)肽酶剪切位點(diǎn) -6 到 -1 和 +1 到 +6 位氨基酸殘基的分析結(jié)果。-3 和 -1 是信號(hào)肽酶特異識(shí)別的位點(diǎn)，-1 位置氨基酸殘基的頻次分別為 Ala（51）、Gly（6）、Ser（5）；-3 位置氨基酸殘基分別為高度保守的小的氨基酸殘基 Val（26）、Ala（22）、Ile（7）、Ser（4）；從圖 1 也可以明顯看出+1 位置多為小的疏水性的氨基酸殘基 Ala、Leu、Ser；另一個(gè)重要而顯著的結(jié)果為 Pro 在 +2 和 +4位置出現(xiàn)頻次最高，再結(jié)合 -1 或 -6 位置出現(xiàn)Gly，可以得出在信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)區(qū)形成一個(gè)β-轉(zhuǎn)角或 Loop 區(qū)是一個(gè)必需的活性結(jié)構(gòu)。

2.1.3 信號(hào)肽功能元件中前導(dǎo)區(qū)的糖基化位點(diǎn) 已有研究證實(shí)釀酒酵母 α-因子信號(hào)肽的前導(dǎo)區(qū)有 3 個(gè)糖基化位點(diǎn)，其位點(diǎn)突變導(dǎo)致融合外泌蛋白的分泌降低[21]。本研究利用 NetNGlyc1.0 計(jì)算程序?qū)γ總€(gè)外泌蛋白進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析，預(yù)測(cè)的糖基化位點(diǎn)與文獻(xiàn)實(shí)際測(cè)定分析到的位點(diǎn)存在很大的差異[14]，可能原因是外泌蛋白豐度本來就較低，而相應(yīng)的肽段很難檢測(cè)。在預(yù)測(cè)的含有前導(dǎo)區(qū)的 16 個(gè)信號(hào)肽功能元件僅有磷脂酶 B（PLB3）含有一個(gè)糖基化位點(diǎn)，已得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)的信號(hào)肽功能元件如 CIS3、HSP150 與 α-因子信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)相似，能夠引導(dǎo)融合異源蛋白的外泌表達(dá)，說明信號(hào)肽前導(dǎo)區(qū)的糖基化不是必需條件。圖 2是含有前導(dǎo)區(qū)的信號(hào)肽功能元件的對(duì)比分析，可以看出有些信號(hào)肽功能元件如 EXG1、SCW4、SCW10和 SUN4 等含有較短的前導(dǎo)區(qū)，但已有研究結(jié)果證實(shí) EXG1 被定位于高爾基體腔中的內(nèi)切酶 Kex2剪切[22]。

2.1.4 信號(hào)肽功能元件中 Kex2 剪切位點(diǎn)的分析 外泌蛋白的信號(hào)肽如含有前導(dǎo)區(qū)，其分泌表達(dá)需要在高爾基體腔內(nèi)被 Kex2 剪切加工，本研究利用計(jì)算程序 ProP1.0 進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，該軟件的精確性較差，使用已得到廣泛證實(shí)的 α-因子信號(hào)肽作對(duì)照進(jìn)行分析，其預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)為 0.374（閾值為 0.5），通過氨基酸序列的比對(duì)分析 16 個(gè)外泌蛋白含有前導(dǎo)區(qū)的信號(hào)肽，僅有 6 個(gè)信號(hào)肽的預(yù)測(cè)值大于0.5（表 2），從圖 2 可以看出前導(dǎo)區(qū) Kex2 剪切位點(diǎn)非常保守（2 個(gè)堿性的氨基酸殘基 Lys-Arg）。

圖 2 預(yù)測(cè)含有前導(dǎo)區(qū)的信號(hào)肽的比對(duì)分析Figure 2 Alignment of predicted signal peptidase and endopeptidase Kex2 cleavage sites

圖 3 工程酵母基因組整合的目的基因的 PCR 鑒定（A：EXG1 DNA 片段；B：α-Factor-EXG1 DNA 片段）Figure 3 PCR verification results of genetically engineered strains with integration of two heterologous genes (A: EXG1 DNA fragments amplified by PCR; B: α-Factor-EXG1 DNA fragments amplified by PCR)

2.2 EXG1 信號(hào)肽功能元件的促分泌活性分析

2.2.1 含 EXG1 信號(hào)肽功能元件融合表達(dá)載體的構(gòu)建和酵母轉(zhuǎn)化 通過生物信息學(xué)分析獲得的16 個(gè)含有前導(dǎo)區(qū)的信號(hào)肽，其中 CIS3、HSP150、PIR3、PIR1 為同一個(gè)家族的外泌蛋白，結(jié)構(gòu)與α-因子信號(hào)肽相似，已有研究結(jié)果證實(shí) HSP150 的信號(hào)肽功能元件具有與 α-因子信號(hào)肽相同的促進(jìn)小鼠唾液酸轉(zhuǎn)移酶分泌的表達(dá)水平[10]；基于其他信號(hào)肽的前導(dǎo)區(qū)都較短的分析結(jié)果，于是推測(cè)其他的前導(dǎo)區(qū)是否具有較 α-因子信號(hào)肽更強(qiáng)的促分泌活性。本研究選取 EXG1 研究目標(biāo)進(jìn)行探索。首先利用 PCR 方法直接從酵母基因組中擴(kuò)增獲得EXG1 整個(gè)基因，亞克隆到釀酒酵母整合型表達(dá)載體 pδGAPh，即得到 pδGAPh-EXG1；同時(shí)利用α-因子信號(hào)肽功能元件作為參照，利用 SOE-PCR獲得編碼 α-因子信號(hào)肽 DNA 片段，直接置換EXG1 自身的信號(hào)肽編碼區(qū)，獲得整合型表達(dá)載體pδGAPh-α-Factor-EXG1。然后轉(zhuǎn)化已基因敲除EXG1 的宿主菌 W303-1b/ΔES，通過潮霉素 B 抗性篩選標(biāo)記進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選，然后通過 PCR鑒定確定 EXG1 和 α-Factor-EXG1 是否整合進(jìn)入宿主的基因組中，結(jié)果如圖 3 所示陽(yáng)性克隆都有預(yù)期的整合基因片段，進(jìn)而純化 DNA 片段并測(cè)序驗(yàn)證。

2.2.2 EXG1 信號(hào)肽功能元件的促分泌活性 EXG1 編碼的外切 β-(1,3)-葡聚糖酶 1 具有水解pNPG 的 β-葡萄糖苷鍵的活性，利用對(duì)硝基苯酚繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 4），標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好；測(cè)定發(fā)酵上清中糖苷水解酶活性，結(jié)果表明使用EXG1 自身的信號(hào)肽比 α-因子信號(hào)肽引導(dǎo)的 β-葡萄糖苷酶水解活性更高，約是后者的 3 倍，同時(shí)也觀察到 EXG1 的高表達(dá)對(duì)細(xì)胞沒有生長(zhǎng)抑制作用。因此，EXG1 的信號(hào)肽功能元件具有較好的促進(jìn)融合蛋白分泌的活性（圖 5）。

圖 4 對(duì)硝基苯酚的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 4 Standard curve of p-nitrophenyl measured by PerkinElmer

圖 5 工程菌的生物量（A）和胞外 β-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定（B）Figure 5 The determinations of biomass (A) and the supernatant enzymatic activities of the recombinant strains (B)

3 討論

釀酒酵母之所以能成為眾多藥用蛋白和工業(yè)催化酶的生產(chǎn)表達(dá)系統(tǒng)，不僅僅是其具有遺傳操作便捷、培養(yǎng)簡(jiǎn)單和繁殖迅速等優(yōu)點(diǎn)，更重要的是其自身具有較強(qiáng)的 ER-Golgi 依賴的分泌途徑[3]。外泌蛋白進(jìn)行分泌表達(dá)的第一個(gè)關(guān)鍵步驟是外源蛋白的信號(hào)肽對(duì)分泌途徑的選擇性，依據(jù)信號(hào)肽識(shí)別體轉(zhuǎn)運(yùn)新合成的外泌蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子機(jī)制把外泌蛋白靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程區(qū)分為翻譯共轉(zhuǎn)移途徑和翻譯后轉(zhuǎn)移途徑。目前在酵母表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛的信號(hào)肽是 α-因子信號(hào)肽功能元件，利用翻譯后轉(zhuǎn)移途徑驅(qū)動(dòng)融合蛋白的外泌表達(dá)，為提高外源蛋白的表達(dá)量提供了一個(gè)靶點(diǎn)。

目前文獻(xiàn)已報(bào)道了多種用于提高異源蛋白在酵母細(xì)胞高效表達(dá)的技術(shù)策略，主要包括對(duì)分泌途徑中相關(guān)基因的敲除或高表達(dá)、優(yōu)化表達(dá)載體系統(tǒng)和發(fā)酵過程及其調(diào)節(jié)伴侶蛋白促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白折疊和二硫鍵的形成[1]。但是如何提高異源蛋白在胞內(nèi)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的內(nèi)膜系統(tǒng)囊腔內(nèi)的轉(zhuǎn)位依然是影響融合蛋白外泌效率的決定因素，其中信號(hào)肽功能元件是在該膜系統(tǒng)內(nèi)轉(zhuǎn)位的關(guān)鍵分子結(jié)構(gòu)。過去很多研究集中在不同信號(hào)肽（實(shí)質(zhì)上是信號(hào)肽的前導(dǎo)區(qū)）的發(fā)現(xiàn)鑒定研究，而對(duì)信號(hào)肽包括前導(dǎo)區(qū)的下游元件對(duì)外泌蛋白的影響研究相對(duì)較少[8]。本研究直接基于釀酒酵母細(xì)胞外泌蛋白質(zhì)組的研究結(jié)果，采用生物信息學(xué)計(jì)算方法，快速發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)蛋白外泌表達(dá)的信號(hào)肽功能元件。經(jīng)計(jì)算分析獲得了 65 個(gè)具有潛在分泌表達(dá)的信號(hào)肽，而這些蛋白絕大多數(shù)定位于細(xì)胞壁或胞外發(fā)酵液；進(jìn)一步分析確定了含有前導(dǎo)區(qū)的 16 個(gè)信號(hào)肽功能元件，這與 Bae 等[10]利用翻譯融合伴侶篩選系統(tǒng)分離鑒定具有較強(qiáng)促進(jìn)人白細(xì)胞介素-2 表達(dá)的多個(gè)信號(hào)肽功能元件（如 ECM33、HSP150、CSI3 和 SCW4）得以相互印證，而后者還融合表達(dá)了信號(hào)肽功能元件下游更長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)蛋白肽段。通過計(jì)算分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可以看出在信號(hào)肽酶剪切位點(diǎn)下游的 +1 到 +6 的肽段含有導(dǎo)致 α-螺旋斷開的 Gly 或 Pro 的氨基酸殘基，推測(cè)可能形成易于信號(hào)肽酶識(shí)別剪切的 β-轉(zhuǎn)角或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是影響信號(hào)肽酶剪切的重要分子結(jié)構(gòu)。

為驗(yàn)證通過計(jì)算方法獲得的信號(hào)肽功能元件的可靠性和促進(jìn)融合蛋白分泌的效率，選取其中與α-因子信號(hào)肽結(jié)構(gòu)不同的 EXG1 的信號(hào)肽功能元件為研究目標(biāo)，利用基因敲除 EXG1 的酵母為表達(dá)宿主消除內(nèi)在 EXG1 的潛在影響因素。研究結(jié)果表明 EXG1 信號(hào)肽功能元件比常用的 α-因子信號(hào)肽功能元件具有更強(qiáng)的促蛋白分泌活性?？傊?，隨著蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組等系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用這些組學(xué)的研究結(jié)果并結(jié)合計(jì)算分析，可以快速地分離鑒定促進(jìn)蛋白外泌表達(dá)的功能元件，這些元件的發(fā)現(xiàn)也將促進(jìn)蛋白質(zhì)工程研究和藥用蛋白的生物合成。