張 軍 李 江 王麗珍 徐 骎

EMP1蛋白在口腔鱗癌組織中的表達及其臨床意義*

張 軍 李 江 王麗珍 徐 骎△

目的：檢測上皮膜蛋白基因1（EMP1）在口腔鱗狀細胞癌（OSCC）組織中的表達及其臨床意義。方法：應用免疫組織化學染色方法對60例OSCC患者組織切片中的EMP1表達進行檢測，分析不同臨床參數(shù)中EMP1的表達差異，并計算EMP1表達評分用于診斷OSCC的靈敏度和特異度。結(jié)果：EMP1主要表達在細胞膜和（或）胞漿中，淋巴細胞及細胞間質(zhì)中無明顯表達。臨床早期OSCC的EMP1表達評分高于晚期，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移OSCC的EMP1表達評分高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學意義。用于診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的靈敏度和特異度分別為61.9%和77.8%，用于診斷OSCC臨床分期的靈敏度和特異度均為70.0%。結(jié)論：EMP1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期存在一定相關(guān)性，可能對臨床診斷和治療OSCC具有指導價值。

口腔腫瘤 癌，鱗狀細胞 免疫組織化學 上皮膜蛋白基因1

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部常見的惡性腫瘤，占頭頸癌的90%左右[1]。前期有研究通過少量標本發(fā)現(xiàn)上皮膜蛋白基因1（EMP1）在OSCC中的表達明顯下調(diào)[2]。本課題前期研究通過PCR及Real time-PCR檢測EMP1在OSCC及鄰近正常組織中的表達情況，提示該基因可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起作用[3]。為進一步證實此結(jié)果，本研究通過對較大樣本OSCC臨床組織標本的驗證，觀察分析EMP1蛋白在體內(nèi)的表達水平及其與臨床特征的關(guān)系，重點判斷EMP1表達評分用于判斷臨床特征的靈敏度和特異度，以評價該基因表達在OSCC發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2009年1月—4月上海市第九人民醫(yī)院收治的60例OSCC患者的石蠟組織塊。該組患者平均年齡（61.7±13.2）歲；其中男36例，女24例；有煙酒史者25例，無煙酒史者35例；發(fā)病部位：舌部32例，頰部14例，腭部3例，牙齦9例，口底2例；18例伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，42例無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；臨床早期和晚期各30例，病理分化Ⅰ級15例，Ⅱ級42例，Ⅲ級3例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 組織切片厚度為5 μm。切片置于68℃恒溫箱中烘烤后放入二甲苯中脫蠟30min，后依次放入100%乙醇中5s，95%乙醇中5s，洗滌2次，蒸餾水洗滌去除乙醇；切片置于H2O2中進行抗原封閉10min；蒸餾水洗片1次，PBS洗片3次，每次5min；多克隆鼠抗人EMP1抗體（Ab?nova，中國臺灣）按1∶200稀釋，滴加抗體后，置暗盒中在4℃下反應過夜；第2天取出暗盒，復溫1 h，PBS洗片3次，每次5min；加入二抗，室溫孵育45min；PBS洗片3次，每次5min；加入適量按1∶80配制的二氨基聯(lián)苯胺（DAB，Sigma，St Louis，Missouri，美國）溶液，顯色約5s，顯微鏡下觀察顯色，PBS中終止反應。蘇木素復染，梯度乙醇中脫水，然后用二甲苯，洗片2次透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察并攝片。

作者單位：300041 天津市口腔醫(yī)院口腔頜面外科（張軍）；上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院（張軍，李江，王麗珍，徐骎）

1.2.2 免疫組化結(jié)果判斷標準 陽性染色百分數(shù)（P）評分標準，0分：<10%；1分：10%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～ 75%；4分：76%～100%。染色強度（I）的評分標準，0：陰性；1：淡黃色；2：褐色；3：深褐色。總的評分（S）=P×I[4]。免疫染色評分由2名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生在雙盲情況下得出。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。2組及多組EMP1表達評分比較采用Mann-Whitney’s或Kruskal-Wallis非參數(shù)統(tǒng)計方法。應用受試者工作曲線（receiver operative curve，ROC）分析計算EMP1表達評分用于診斷OSCC的靈敏度和特異度，根據(jù)閾值對該組患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤早晚期的判斷進行卡方（χ2）檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學染色結(jié)果 EMP1主要表達在細胞膜和（或）胞漿中，淋巴細胞及細胞間質(zhì)中無明顯表達。在30例早期患者中有27例（90.0%），42例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中有30例（71.4%）的鱗癌細胞胞膜和胞漿中EMP1為褐或深褐色染色，見圖1A、C；在30例晚期腫瘤患者中有15例（50.0%），18例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的10例（55.6%）鱗癌細胞胞膜和胞漿中EMP1為淡黃色或褐色染色，見圖1B、D。

Figure 1 The staining of EMP1 in OSCC cells (Immunohistochemistry×200)圖1 EMP1在OSCC細胞中的染色（免疫組織化學×200）

2.2 不同臨床參數(shù)之間EMP1表達評分的比較 臨床早期OSCC的EMP1表達評分高于晚期，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移OSCC中EMP1表達評分高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

Table 1 Comparison of expression levels of EMP1 in different clinical characterization groups表1 不同臨床特征EMP1表達水平比較 M（P25,P75）

2.3 EMP1用于診斷OSCC的靈敏度和特異度 EMP1表達評分用于診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的靈敏度和特異度分別為61.9%和77.8%，見圖2；用于診斷OSCC早晚分期的靈敏度和特異度均為70.0%，見圖3；EMP1表達總評分的閾值為7。以7為閾值，診斷淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和癌癥早晚分期差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表2。

Figure 2 ROC analysis of diagnosing lymph node metastasis using EMP1 expression scores圖2 EMP1表達評分判斷淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移的ROC曲線

Figure 3 ROC analysis of diagnosing early or advanced OSCC using EMP1 expression scores圖3 EMP1表達評分判斷早晚期OSCC的ROC曲線

Table 2 Results of EMP1 expression scores for diagnosing lymph node metastasis and early or advanced stage of OSCC表2 EMP1表達評分閾值診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及早晚期OSCC的結(jié)果

3 討論

EMP1基因是在1995年由瑞士學者Taylor等[5]從胎鼠腸cDNA文庫中克隆出并命名的，其編碼4個跨膜結(jié)構(gòu)域，分子質(zhì)量約18 ku。在鱗狀上皮中富含該基因的mRNA[6]。Gnirke等[7]觀察幾種有不同轉(zhuǎn)移特點的人乳腺癌細胞發(fā)現(xiàn)，該基因表達與細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移特性有關(guān)。Wang等[8]認為EMP1基因可能是參與細胞信號傳導、細胞通信及黏附調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)因子之一。Zhang等[3]研究發(fā)現(xiàn)OSCC中的EMP1基因表達下調(diào)，且其下調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在OSCC中的表達明顯下調(diào)，說明其可能參與了該疾病的發(fā)生和發(fā)展，且EMP1的表達在早、晚期腫瘤及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤間存在差異，提示EMP1可能成為OSCC分子診斷、治療的一種新的候選標志物。

目前治療OSCC的有效手段是手術(shù)擴大切除病灶，同時在手術(shù)前后輔以化療和（或）放療，但生存率并不十分令人滿意，只有60%的患者可以生存5年[9]。因此，臨床實踐中更應該注意OSCC早期發(fā)現(xiàn)的重要性，同時需要仔細考慮患者個體治療方法模式的選擇，臨床醫(yī)生在為了保存器官及其功能和處理相關(guān)并存情況時，要把注意力集中在最有效的治療方法上[10]，這樣才能減少失敗，提高患者生存期及改善生活質(zhì)量。OSCC的傳統(tǒng)治療方法和預后主要依據(jù)TNM分類，該系統(tǒng)對于早期OSCC來講具有主觀性和缺乏提示作用，并且對該疾病的嚴重程度、預后和治療反應提供的信息少，而早期發(fā)現(xiàn)OSCC是提高生存率的最有效方法[11]。本研究通過ROC曲線分析，得出閾值為7的評分標準，以該閾值對本組患者是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤早晚分期進行卡方檢驗，差異有統(tǒng)計學意義，提示該閾值可能在制定治療方案時有參考作用?？傊?，結(jié)合TNM分類系統(tǒng)，EMP1的表達評分可能為臨床醫(yī)生選擇治療方法、判斷預后或預測疾病嚴重程度方面提供一些有價值的信息。

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（2011-11-03收稿 2012-03-22修回）

（本文編輯 閆娟）

Protein Levels and Clinical Significance of EMP1 in Oral Squamous Cell Carcinoma

ZHANG Jun,LI Jiang,WANG Lizhen,XU Qin
Department of Oral Maxillofacial Surgery,Tianjin Stomatology Hospital,Tianjin 300041，China

Objective:To investigate the protein level and significance of epithelial membrane protein-1(EMP1)in oral squamous cell carcinoma(OSCC)tissues.Methods:Immunohistochemical method was used to determine the expression of EMP1 in 60 samples of OSCC.The difference of EMP1 expression in clinical parameters was analyzed.Scores of EMP1 ex?pression was calculated for diagnosis of OSCC.Results:The expression of EMP1 was found in the cell membrane or cyto?plasm.There were no significant expressions in lymphocytes and intercellular substance.There was a higher expression of EMP1 in the early clinical stage of OSCC than that of later clinical stage of OSCC.There was a significantly higher expression of EMP1 in no lymph node metastasis than that of lymph node metastasis of OSCC.The sensitivity and specificity used for pre?diction of expressive scores of EMP1 were 61.90%and 77.80%,and the sensitivity and specificity used for clinical stage were both 70.0%,respectively.Conclusion:Expression of EMP1 was correlated with lymph node metastasis and clinical stage, which may has guidance significance for clinical practice.

mouth neoplasms carcinoma,squamous cellimmunohistochemistry epithelial membrane protein-1

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.002

*上海市科委科研計劃項目（項目編號：08JC1414400）

△通訊作者E-mail:xuqin_2004@hotmail.com