李 燾，萬志先，羅 然，王雄偉△，曾 暉，劉朝奇，汪 雷，王 煒，孫 麗

（1.武漢科技大學(xué)附屬普仁醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢430081；2.三峽大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所／宜昌市中心人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北宜昌443003；3.三峽大學(xué)分子生物研究所，湖北宜昌443003）

LY294002聯(lián)合順鉑對腦膠質(zhì)瘤U87細胞株增殖的影響＊

李 燾1，萬志先2＃，羅 然2，王雄偉2△，曾 暉2，劉朝奇3，汪 雷2，王 煒2，孫 麗3

（1.武漢科技大學(xué)附屬普仁醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢430081；2.三峽大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所／宜昌市中心人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北宜昌443003；3.三峽大學(xué)分子生物研究所，湖北宜昌443003）

目的體外觀察磷酸肌醇－3激酶（PI3K）特異性抑制劑LY294002與順鉑（CDDP）聯(lián)合對人腦膠質(zhì)瘤U87細胞株增殖的抑制作用。方法采用細胞毒實驗（MTT）法、流式細胞術(shù)（FCM）檢測LY294002單獨或聯(lián)合CDDP對人腦膠質(zhì)瘤U87細胞增殖的抑制作用，并觀察細胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果LY294002與CDDP均能抑制U87細胞生長，呈劑量依賴性，兩者聯(lián)合有協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)CDDP為0.625μg／mL和LY294002為5μmol／L時達到最大協(xié)同作用（Q＝1.21），F(xiàn)CM檢測細胞被阻滯在G1期，S期細胞比例減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論LY294002能有效提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞對CDDP的敏感性，本研究為兩種化療藥物在臨床上的聯(lián)合應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；藥物療法；順鉑；LY294002；增殖抑制

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，單一的手術(shù)切除難以治愈，化療是術(shù)后的主要輔助治療手段，以順鉑為主的聯(lián)合化療是多種腫瘤的一線治療方案，它可以聯(lián)合多西他賽、依托泊苷、吉西他濱等治療非小細胞肺癌、食管小細胞癌和乳腺癌［1－3］。磷脂酰肌醇－3 激 酶／絲 氨 酸－蘇 氨酸蛋白 激 酶（PI3K／Akt）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被認(rèn)為是腫瘤細胞存活的首要通路，與LY294002是PI3K特異性抑制劑，近年研究表明LY294002可以增強某些抗腫瘤藥物的療效，減少化療抵抗作用［4－6］。但LY294002聯(lián)合順鉑（CDDP）對人膠質(zhì)瘤 U87細胞生長的影響未見報道。本研究以膠質(zhì)瘤細胞株U87為研究對象，觀察LY294002和CDDP對U87細胞增殖的抑制作用及細胞形態(tài)的變化，為臨床增強神經(jīng)膠質(zhì)瘤化療療效提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 腦膠質(zhì)瘤細胞株U87由自華中科技大學(xué)附屬同濟醫(yī)院神經(jīng)外科實驗室惠贈。在5%CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清（美國Sigma公司）的RPMI－1640培養(yǎng)基（美國Sigma公司）培養(yǎng)，2～3d更換1次培養(yǎng)液，待細胞融合達80%時即消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2 主要試劑 LY294002粉劑購自美國Cayman公司，CDDP購自齊魯制藥有限公司。四甲基偶氮唑藍（MTT）細胞增殖分析試劑為Promega公司產(chǎn)品。全波長酶標(biāo)儀為Thermo公司產(chǎn)品。Epics XL－4流式細胞儀（FCM）為Beckman Coulte公司產(chǎn)品。Eclipes TE2000－S倒置熒光顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 細胞毒實驗（MTT）法檢測細胞的增殖抑制率 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整到所需細胞濃度，接種于96孔培養(yǎng)板（100微升／孔），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。實驗分組如下：（1）LY294002組分別按濃度梯度給藥濃度為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0μmol／L；（2）CDDP組分別按濃度梯度給藥0.315、0.625、1.250、2.500、5.100μg／mL；（3）聯(lián)合用藥組分別加入上述兩種藥物，兩藥相應(yīng)濃度以1∶1相互組合。以上3組為實驗組，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。設(shè)實驗對照組和空白對照孔（對照組）。給藥后繼續(xù)置于5%CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，微量振蕩器震蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長在570nm的吸光度（A值）。實驗重復(fù)3次，均設(shè)3個復(fù)孔，取3個復(fù)孔的均值為最終結(jié)果。按以下公式計算各組細胞的增殖抑制率（IR）。IR＝（1－實驗孔A／對照孔A）×100%。按金正均提出的概率和法計算Q值并判斷兩藥的協(xié)同作用［7］。Q＝E（A＋B）／［EA＋（1－EA）×EB］，其中E（A＋B）為兩藥聯(lián)合應(yīng)用時的細胞增殖抑制率，EA和EB分別為兩藥單獨應(yīng)用時的細胞增殖抑制率。當(dāng)Q為0.85～1.15時，表示兩藥作用相加；當(dāng)Q＞1.15時，表示兩藥作用協(xié)同；當(dāng)Q＜0.85時，表示兩藥相互拮抗。

1.3.2 流式細胞儀檢測細胞周期分布及凋亡 選取Q＞1.15即CDDP 0.625μg／mL，LY294002 5μmol／L單用或聯(lián)合48h作為藥物實驗組。細胞懸浮磷酸鹽緩沖液（PBS）中，1 000r／min，離心10min，去上清液，調(diào)整細胞數(shù)至2×106，細胞懸液用70%的冰乙醇固定，4℃固定過夜，離心去除固定液，PBS清洗1次，RNA酶37℃處理1h，與碘化丙啶（PI）在37℃反應(yīng)30min，上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3.3 細胞形態(tài)學(xué)觀察 用6孔培養(yǎng)板接種細胞過夜，分別用LY294002與CDDP單獨和聯(lián)合作用U87細胞48h后，用倒置熒光顯微鏡觀察培養(yǎng)板中U87細胞用藥前后的形態(tài)變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示。同一藥物不同濃度組間采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD－t檢驗，α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度LY294002和CDDP單藥及聯(lián)合用藥對膠質(zhì)瘤U87細胞的抑制作用 LY294002和CDDP對U87細胞體外生長有明顯的抑制作用（封2圖1），其抑制率呈劑量依賴關(guān)系（P＜0.01），兩者聯(lián)合抑制作用增加（P＜0.05），見表1。經(jīng)計算Q值顯示，兩種藥物聯(lián)合均有相加作用；LY294002和CDDP濃度分別為0.625μg／mL和5μmol／L時具有協(xié)同作用（P＞1.15），見表2。

表1 LY294002與CDDP單用或者聯(lián)合48h對U87細胞的增殖抑制作用（n＝3，±s）

表1 LY294002與CDDP單用或者聯(lián)合48h對U87細胞的增殖抑制作用（n＝3，±s）

＊：P＜0.01，組內(nèi)比較；○：P＜0.05，與單藥組比較。

組別 劑量 抑制率（%）對照組LY294002（μmol／L） 2.500 0 16.3±1.3＊5.000 0 23.1±1.0＊10.000 0 31.6±2.1＊20.000 0 35.4±1.1＊40.000 0 47.1±2.2＊80.000 0 52.8±1.0＊CDDP（μg／mL） 0.312 5 19.7±2.1＊0.625 0 27.0±1.5＊1.250 0 47.7±1.6＊2.500 0 60.1±1.4＊5.000 0 68.5±1.2＊10.000 0 75.4±2.7＊LY294002聯(lián)合CDDP（μmol／L、μg／mL） 2.5＋0.312 5 35.0±1.3＊○5.0＋0.625 0 51.4±2.1＊○10.0＋1.250 0 56.2±1.3＊○20.0＋2.500 0 66.4±1.2＊○40.0＋5.000 0 76.1±2.4＊○80.0＋10.000 0 80.3±1.8＊○

表2 LY294002聯(lián)合CDDP作用48h膠質(zhì)瘤U87細胞的Q值

2.2 流式細胞術(shù)分析 根據(jù)MTT實驗結(jié)果，選取Q值最大的CDDP和LY294002濃度，即CDDP 0.625μg／mL，LY294002 5 μmol／L單用或聯(lián)合48h作為藥物實驗組。LY294002和CDDP單用或聯(lián)用均表現(xiàn)改變細胞周期的活性，兩藥聯(lián)合作用G1期細胞比例較單藥組增加更明顯，S期減少（P＜0.01），而G2期比例變化不大，見表3。

表3 LY294002聯(lián)合CDDP 48h對U87細胞周期的影響（n＝3，±s）

表3 LY294002聯(lián)合CDDP 48h對U87細胞周期的影響（n＝3，±s）

＊：P＜0.01，與對照組比較；▲：P＜0.01，與單藥組比較。

組別細胞周期分布（%）G0／G1 S G2／M對照組48.3±3.1 45.0±2.9 6.7±1.7 LY294002組 64.3±2.3＊ 29.1±1.8＊ 6.5±2.2 CDDP組 66.2±2.8＊ 27.0±2.5＊ 6.8±2.6聯(lián)合用藥組 73.4±2.1＊▲ 19.6±1.7＊▲7.4±1.8

2.3 細胞形態(tài) 倒置顯微鏡下，對照組U87細胞呈單層生長，生長密度大，呈梭形或三角形，核分裂相多，實驗組經(jīng)LY294002或CDDP處理后，膠質(zhì)瘤細胞逐漸減少，體積變小，胞質(zhì)透亮度下降，顆粒感增強，細胞突觸變短、變圓，部分細胞胞突回縮變圓，脫落呈懸浮狀，而CDDP聯(lián)合LY294002用藥處理的細胞，上述變化更加顯著，并可見細胞形態(tài)破壞，胞膜破裂，細胞凋亡。

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤約占顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤的40%，膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是神經(jīng)膠質(zhì)瘤中一種最常見的、惡性程度最高的一種類型，預(yù)后極差，超過90%的GBM是原發(fā)性GBM，絕大部分患者在確診后的生存期只有1年，2年生存期的患者小于10%［8］，目前主要采取以手術(shù)切除為主、放化療為輔的綜合治療。

在體外試驗中，所有化療藥物在高劑量時均會對腫瘤生長有抑制作用，但是，某種化療藥物能否成功運用于臨床的關(guān)鍵是其療效與毒性劑量之間的安全范圍，如何上調(diào)腫瘤細胞對化療的敏感性至關(guān)重要?；熋舾行杂赡[瘤細胞的固有耐藥和化療中的獲得性耐藥決定，腫瘤細胞對化療藥物的固有耐藥不能改變，只能通過調(diào)節(jié)獲得性耐藥增強化療藥物的敏感性。CDDP廣泛運用于臨床，為鉑的金屬絡(luò)合物，作用似烷化劑，主要作用靶點為DNA，作用于DNA鏈間及鏈內(nèi)交鏈，形成DDPDNA復(fù)合物，干擾DNA復(fù)制，或與核蛋白及胞漿蛋白結(jié)合，研究發(fā)現(xiàn)CDDP可以激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括Fas／FasR、ATR、p53及MAPK信號通路，最終通過活化Caspase－3促進細胞凋亡［9］。

PI3K／Akt細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被認(rèn)為是腫瘤細胞存活的首要通路，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤細胞惡性增殖、轉(zhuǎn)移以及對放、化療的拮抗起著重要作用［10］。近年來應(yīng)用信號通路靶點抑制劑與放、化療結(jié)合治療的方法，為腫瘤的治療開辟了一條新的途徑，日益受到癌癥研究者得重視。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化的Akt可以將Bad磷酸化，磷酸化的Bad失去與Bcl－XL結(jié)合的能力，恢復(fù)了Bcl－2的抗凋亡能力，通過控制細胞色素C從線粒體的釋放來介導(dǎo)Csapases家族的活性［11］。Fujiwara等［12］發(fā)現(xiàn)，CDDP可以誘導(dǎo)胰腺癌細胞中 Akt活化，LY294002通過抑制Akt和Bad的磷酸化，上調(diào)Caspase－3的表達，從而增加了胰腺癌AsPC－1、PANC－1細胞對CDDP的敏感性，并在動物實驗中得到證實。Asechi等［13］認(rèn)為，survivin的表達上調(diào)介導(dǎo)了大鼠肝癌細胞K－251對CDDP的耐藥，LY294002通過抑制survivin的表達增加腫瘤細胞對CDDP的敏感性。

本研究主要探討LY294002聯(lián)合CDDP是否可以增強對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞的增殖抑制作用，以期改善化療藥物對預(yù)防腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的效果。本研究發(fā)現(xiàn)，在體外環(huán)境下LY294002聯(lián)合CDDP能增強對膠質(zhì)瘤U87細胞的增殖抑制作用。當(dāng) LY294002濃度為5μmol／L、CDDP 0.625μg／mL時，聯(lián)合用藥存在協(xié)同作用（Q＝1.21），說明LY294002有增加CDDP治療效果的作用。FCM結(jié)果表明，用相同劑量的CDDP作用U87細胞，在LY294002干預(yù)后，G1期細胞比例增加，S期細胞減少，G2期變化不大。本研究發(fā)現(xiàn)，LY294002和CDDP單藥組可以抑制細胞增殖，聯(lián)合用藥組抑制作用更加明顯。

總之，本研究已證實LY294002和CDDP能協(xié)同抑制人膠質(zhì)瘤細胞株U87增殖，但LY294002增強膠質(zhì)瘤對CDDP敏感性的分子機制尚未明確，有待進一步研究。

［1］申潔，賀外信.多西他賽聯(lián)合順鉑治療非小細胞肺癌近期療效觀察［J］.中華實用診斷與治療雜志，2012，26（1）：68－69.

［2］劉鶯，曹婧，張艷玲，等.依托泊甙聯(lián)合順鉑治療食管小細胞癌的療效［J］.腫瘤防治研究，2011，38（12）：1423－1425.

［3］王蓓，王淅，呂曉皚.吉西他濱聯(lián)合順鉑一線治療晚期三陰乳腺癌療效分析［J］.實用腫瘤雜志，2011，26（5）：507－509.

［4］王晶宇，王志平，趙俊麗，等.LY294002聯(lián)合姜黃素對人膀胱癌EJ細胞的體外抑制作用［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2011，27（1）：37－41.

［5］Chen L，Han L，Shi Z，et al.LY294002enhances cytotoxicity of temozolomide in glioma by down－regulation of the PI3K／Akt pathway［J］.Mol Med Report，2012，5（2）：575－579.

［6］Wu D，Tao J，Xu B，et al.Phosphatidylinositol 3－kinase inhibitor LY294002suppresses proliferation and sensitizes doxorubicin chemotherapy in bladder cancer cells［J］.Urol Int，2011，87（1）：105－113.

［7］金正均.合并用藥中的相加［J］.中國藥理學(xué)報，1980，1（2）：70－76.

［8］Schwartzbaum JA，F(xiàn)isher JL，Aldape KD，et al.Epidemiology and molecular pathology of glioma［J］.Nat Clin Practice，2006，2（9）：494－503.

［9］Brozovic A，Osmak M.Activation of mitogen－activated protein kinases by cisplatin and their role in cisplatin－resistance［J］.Cancer Lett，2007，251（1）：1－16.

［10］Morgensztern D，McLeod HL.PI3K／Akt／mTOR pathway as a target for cancer herapy［J］.Anti Cancer Drugs，2005，16（8）：797－803.

［11］Chong ZZ，Maiese K.Targeting WNT，protein kinase B，and mitochondrial membrane integrity to foster cellular survival in the nervous system［J］.Histol Histopathol，2004，19（2）：495－504.

［12］Fujiwara M，Izuishi K，Sano T，et al.Modulating effect of the PI3－kinase inhibitor LY294002on cisplatin in human pancreatic cancer cells［J］.J Exp Clin Cancer Res，2008，27：76.

［13］Asechi H，Hatano E，Nitta T，et al.Resistance to cisplatin－induced apoptosis via PI3K－dependent survivin expression in a rat hepatoma cell line［J］.Int J Oncol，2010，37（1）：89－96.

Effect of LY294002 combined with CDDP on proliferation in glioma U87 cells in vitro＊

Li Tao1，Wan Zhixian2＃，Luo Ran2，Wang Xiongwei2△，Zeng Hui2，Liu Chaoqi3，Wang Lei2，Wang Wei2，Sun Li3
（1.Departmnet of Neardogy，Pu Ren Hospital Wuhan University of Science and Techndogy，Wuhan，Hubei 430081，China；2.Department of Neurosurgery，The First College of Clinical Medical Science，China Three Gorges University，Yichang，Hubei 443003 China；3.Institute of Neurology，China Three Gorges University，Yichang，Hubei 443002，China）

ObjectiveTo investigate the effects of LY294002and CDDPiamycin（CDDP）on proliferation of glioma cancer cell line U87.MethodsMTT assay was used to examine the inhibition rate cell growth when cells were treated at various concentrations of LY294002and CDDP alone or combination.Cell cycle and apoptosis rate of U87cells were detected by flow cytometry（FCM）after using drugs.Optic microscope was used to detect the morphological changes of U87cells.ResultsBoth LY294002 and CDDP exhibited a dose dependent inhibitory effect on the proliferation of U87cells.The combination of LY294002and CDDP exerted a synergistic effect on U87cell growth inhibition.LY294002in the concentration of 5μmol／L and CDDP in the concentration of 0.625μg／mL interaction was the most synergistic（Q＝1.21）.Combined treatment group raised U87cells′apoptosis and induced G1phase arrest compare with single drug treatment group（P＜0.01）.ConclusionLY294002could effectively induce U87 sensitivity to CDDP.And this conclusion provides theoretical basis for the conbined clinical use of LY294002and CDDP.

glioma；drug therapy；cisplatin；LY294002；growth inhibiting

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.002

A

1671－8348（2012）35－3692－03

宜昌市科技基金資助項目（A01301－10）。 ＃ 共同第一作者。 △

，Tel：13908600067；E－mail：wangxiongwei11＠yahoo.com。

2012－06－13

2012－09－12）

·論 著·