繆肖波，劉求真，姚開泰，肖廣惠

（南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，廣州510515）

胃癌是世界常見惡性腫瘤之一［1］，目前早期胃癌多采用手術(shù)治療為主的綜合治療，而對(duì)于中晚期患者，化療則是綜合治療的重要措施之一［2］。然而導(dǎo)致化療失敗的重要原因就是化療過程中形成的多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）［3］。多藥耐藥性是指惡性腫瘤細(xì)胞接觸一種抗癌藥后，繼而對(duì)多種結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制各異的其他抗癌藥產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象［4］，其成為化療失敗以及緩解后復(fù)發(fā)的主要原因。因此，尋找能夠逆轉(zhuǎn)MDR的藥物成為胃癌研究的熱點(diǎn)。丙戊酸鹽（Valproate）是一種短鏈脂肪酸，目前在臨床上被作為一線藥物用來治療癲癇［5－6］，后有實(shí)驗(yàn)證明丙戊酸鹽具有抑制組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）的作用［7］，這類抑制劑被稱為組蛋白去乙?；敢种苿?，是一種新型且有效的抗腫瘤藥物，可促進(jìn)組蛋白乙酰化，激活某些基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯、促進(jìn)細(xì)胞分化和凋亡，并具有抑制腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移的作用［8］。丙戊酸鹽作為抗腫瘤藥物的臨床實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)選擇SGC－7901和SGC－7901／VCR細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察丙戊酸鹽對(duì)耐藥細(xì)胞SGC－7901／VCR耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株SGC－7901及其耐藥株SGC－7901／VCR由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心提供，將細(xì)胞置入含青／鏈霉素100U／mL青／鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱密閉條件下培養(yǎng)，每3天換1次液。

1.2 主要試劑和藥物 胎牛血清、RRPMI－1640培養(yǎng)液、青／鏈霉素（Gibco）；MTT（Sigma）；二甲亞砜（DMSO，Sigma）；長春新堿（VCR，深圳萬樂藥業(yè)）；丙戊酸鹽（Chalbiochem）；Annexin V－FITC／PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（凱基生物）；抗乙?；M蛋白3（acetylated histone H3，AcH3）單克隆抗體、β－Actin抗體（Santa Cruz）。

1.3 MTT法檢測(cè)SGC－7901及SGC－7901／VCR細(xì)胞對(duì) VCR及丙戊酸鹽的敏感性 以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μL，每組3孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照（僅加培養(yǎng)基），分別加入 VCR（濃度梯度為10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.320、0.160和0.000μmol／L）或丙戊酸鹽（濃度梯度為32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5和0.0mmol／L）培養(yǎng)48 h后，每孔加入5mg／mL的MTT 20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，室溫孵育10min，微振蕩器振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，以空白對(duì)照孔調(diào)零，測(cè)定OD值，繪制耐藥曲線。IC50軟件分析SGC－7901和SGC－7901／VCR細(xì)胞對(duì)VCR及丙戊酸鹽的IC50，并計(jì)算耐藥指數(shù)，對(duì)某一藥物的RI＝耐藥細(xì)胞IC50／親本細(xì)胞IC50。

1.4 丙戊酸鹽對(duì)耐藥細(xì)胞SGC－7901／VCR耐VCR的逆轉(zhuǎn)作用 制備單細(xì)胞懸液，接種于96空培養(yǎng)板，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜，待細(xì)胞完全貼壁后，加入藥物。MTT法檢測(cè)丙戊酸鹽對(duì)耐藥細(xì)胞SGC－7901／VCR耐VCR的逆轉(zhuǎn)時(shí)，VCR設(shè)8個(gè)藥物梯度，分別為10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.320、0.160和0.000μmol／L；丙戊酸鹽設(shè)3個(gè)藥物梯度，分別為1.0、0.5和0.0mmol／L。共設(shè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：（1）VCR；（2）0.5mmol／L ＋ VCR；（3）1.0mmol／L ＋ VCR。加入藥物繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入5mg／mL的 MTT 20 μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，室溫孵育10min，微振蕩器振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，以空白對(duì)照孔調(diào)零，測(cè)定OD值，繪制耐藥曲線。觀察耐藥細(xì)胞SGC－7901／VCR對(duì)VCR的敏感性，計(jì)算IC50和逆轉(zhuǎn)指數(shù) （逆轉(zhuǎn)指數(shù)＝使用逆轉(zhuǎn)藥物前IC50／使用逆轉(zhuǎn)藥物后IC50）。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集對(duì)數(shù)生長期的SGC－7901／VCR細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)、鋪板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)12h細(xì)胞完全貼壁后，進(jìn)行不同處理（未處理組、1.0μmol／L VCR處理組、0.5mmol／L丙戊酸鹽處理組、1.0 mmol／L 丙戊酸鹽處理組、1.0μmol／L VCR ＋ 0.5mmol／L丙戊酸鹽處理組和1μmol／L VCR＋1.0mmol／L丙戊酸鹽處理組），藥物作用48h后，收集所有細(xì)胞（包括液體中懸浮的細(xì)胞）后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106／mL。SGC－7901／VCR細(xì)胞未處理組分別設(shè)空白對(duì)照管和凋亡檢測(cè)管，其余藥物處理組只設(shè)凋亡檢測(cè)管。凋亡檢測(cè)管反應(yīng)容積為100μL，加入FITC－Annexin V和PI各5μL后室溫避光孵育30min。孵育完成后，D－Hanks洗滌2次后D－h(huán)anks重懸，上BD公司FACSAria型號(hào)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并計(jì)算總凋亡率（早期凋亡＋晚期凋亡）。

1.6 Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SGC－7901／VCR細(xì)胞中乙酰化組蛋白AcH3的表達(dá) 首先提取親代細(xì)胞SGC－7901和耐藥細(xì)胞SGC－7901／VCR的總蛋白，檢測(cè)兩細(xì)胞中AcH3的表達(dá)差異。繼而用不同濃度（0.0、0.5、1.0或2.0mmol／L）的丙戊酸鹽作用于SGC－7901／VCR細(xì)胞48h或同一濃度（1mmol／L）作用12、24、48h后，檢測(cè)丙戊酸鹽其影響AcH3表達(dá)的規(guī)律。為了明確丙戊酸鹽對(duì)AcH3的特異性，4種處理方法（未處理、1.0μmol／L VCR、1.0mmol／L 丙戊酸鹽和1.0μmol／L VCR＋1.0mmol／L丙戊酸鹽）處理SGC－7901／VCR細(xì)胞48h后，檢測(cè)細(xì)胞中AcH3的表達(dá)。提取的蛋白經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度后，煮沸變性上樣于SDS－PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，然后依次結(jié)合AcH3單克隆抗體和HRP標(biāo)記的二抗，將ECL發(fā)光液Solution A和Solution B按1∶1比例混合，Bio－Rad公司molecular Imager ChemiDocTM XRS＋成像系統(tǒng)下采集曝光圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析；One－way ANOVA比較同一細(xì)胞不同處理組的差異；兩細(xì)胞不同藥物處理的凋亡率數(shù)據(jù)采用析因設(shè)計(jì)方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SGC－7901及SGC－7901／VCR細(xì)胞對(duì) VCR及丙戊酸鹽的敏感性 與親代細(xì)胞SGC－7901相比，耐藥細(xì)胞SGC－7901對(duì) VCR 不敏感，IC50分 別為 （0.073±0.020）μmol／L 和（2.530±0.287）μmol／L，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝ －14.793，P＝0.004），耐藥倍數(shù)為36.0。而SGC－7901和SGC－7901／VCR細(xì)胞對(duì)丙戊酸鹽的IC50分別為3.681±0.889 mmol／L和3.313±0.511mmol／L，兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.621，P＝0.568），這表明 SGC－7901和 SGC－7901／VCR對(duì)丙戊酸鹽的敏感性基本相同。根據(jù)丙戊酸鹽抑制細(xì)胞增殖曲線可知，丙戊酸鹽在0.5mmol／L和1mmol／L時(shí)，對(duì)SGC－7901和SGC－7901／VCR細(xì)胞的抑制作用較弱，細(xì)胞存活率大于60%，細(xì)胞毒性較弱，本研究選擇這兩個(gè)濃度作為逆轉(zhuǎn)耐藥時(shí)的藥物處理濃度，見表1。

表1 MTT比較SGC－7901和SGC－7901／VCR細(xì)胞的耐藥能力（±s，n＝3）

表1 MTT比較SGC－7901和SGC－7901／VCR細(xì)胞的耐藥能力（±s，n＝3）

IC50細(xì)胞系VCR（μmoL） 丙戊酸鹽（mmol／L）SGC－7901 0.073±0.020 3.681±0.889 SGC－7901／VCR 2.530±0.287 3.313±0.511 t－14.793 0.621 P 0.004 0.568耐藥指數(shù)36.0 1.0

2.2 丙戊酸鹽對(duì)SGC－7901／VCR細(xì)胞耐VCR的逆轉(zhuǎn)作用與SGC－7901細(xì)胞相比，SGC－7901／VCR細(xì)胞對(duì) VCR 的耐藥指數(shù)約為36.0。為了檢測(cè)丙戊酸鹽對(duì)耐藥細(xì)胞耐VCR逆轉(zhuǎn)作用的效果，將丙戊酸鹽與VCR聯(lián)用，在0.5mmol／L或1.0 mmol／L丙戊酸鹽存在的條件下，SGC－7901／VCR細(xì)胞對(duì)VCR的敏感性明顯增加，IC50由（2.433±0.208）μmol／L分別降為（0.850±0.132）μmol／L和（0.433±0.104）μmol／L，且隨著丙戊酸鹽濃度的上升逆轉(zhuǎn)作用增強(qiáng)，各處理組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝139.826，P＝0.000），逆轉(zhuǎn)指數(shù)分別為2.86和5.62，見表2。

2.3 丙戊酸鹽與VCR聯(lián)用可增加SGC－7901／VCR細(xì)胞的凋亡率 為了檢測(cè)丙戊酸鹽單用或聯(lián)合VCR使用后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，將耐藥細(xì)胞SGC－7901／VCR依次進(jìn)行6種處理，分別為未處理、1.0μmol／L VCR處理、0.5mmol／L丙戊酸鹽處理、1.0mmol／L 丙 戊 酸 鹽 處 理、1.0μmol／LVCR＋0.5 mmol／L丙戊酸鹽處理和1.0μmol／L VCR＋0.5mmol／L丙戊酸鹽處理。48h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示凋亡率分別為（3.600±0.552）%、（11.600±2.193）%、（12.133±2.103）%、（17.967±2.616）%、（32.7±2.685）%和（41.900±3.659）%。除1.0μmol／L VCR處理組與0.5mmol／L丙戊酸鹽處理組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，其余各組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此結(jié)果表明丙戊酸鹽與VCR聯(lián)用可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，且這種作用具有濃度依賴性，見圖2。

表2 丙戊酸鹽對(duì)SGC－7901／VCR細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用（n＝3）

圖2 丙戊酸鹽與VCR聯(lián)用對(duì)SGC－7901／VCR細(xì)胞凋亡的影響（n＝3）

圖3 丙戊酸鹽誘導(dǎo)SGC－7901／VCR細(xì)胞中組蛋白的增加

2.4 丙戊酸鹽逆轉(zhuǎn)SGC－7901／VCR細(xì)胞耐藥的機(jī)制 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與親代細(xì)胞SGC－7901相比，耐藥細(xì)胞SGC－7901／VCR的 AcH3的表達(dá)降低（圖3A）。未處理、1 μmol／LVCR、1.0mmol／L丙戊酸鹽和1μmol／L VCR ＋1.0 mmol／L丙戊酸鹽等4種處理后 SGC－7901／VCR 細(xì)胞中AcH3檢測(cè)結(jié)果顯示：與未處理組相比，1.0mmol／L丙戊酸鹽和1.0μmol／L VCR＋1.0mmol／L丙戊酸鹽處理組AcH3表達(dá)明顯增高，而1.0μmol／L VCR處理組無變化（圖3B）。這說明丙戊酸鹽能夠增加SGC－7901／VCR細(xì)胞中AcH3的表達(dá)。用0.5、1.0或2.0mmol／L丙戊酸鹽分別處理SGC－7901／VCR細(xì)胞48h后，AcH3的表達(dá)量隨藥物濃度的上升而逐漸增加（圖3C）；用同一濃度（1.0mmol／L）的丙戊酸鹽處理SGC－7901／VCR細(xì)胞12、24、48h后發(fā)現(xiàn)，隨處理時(shí)間的延長，AcH3的表達(dá)量也逐漸增加（圖3D）。這說明丙戊酸鹽增加AcH3的表達(dá)具有濃度和時(shí)間依賴性。

3 討 論

在近代腫瘤治療進(jìn)程中，MDR已成為影響化療效果和遠(yuǎn)期預(yù)后的重要因素［9］。自1970年Bieder等［10］首次闡述 MDR以來，對(duì)MDR形成機(jī)制的研究持續(xù)存在。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是治療失敗的主要原因，也是臨床所需要解決的難題［11］。由于腫瘤細(xì)胞發(fā)生MDR的機(jī)制十分復(fù)雜，因此選擇理想的耐藥細(xì)胞模型是解決問題最基本的條件。本研究選擇的耐藥細(xì)胞SGC－7901／VCR與親代細(xì)胞 SGC－7901相比對(duì)VCR化療藥物均有較強(qiáng)耐藥性，耐藥倍數(shù)高達(dá)36.0，是研究逆轉(zhuǎn)耐藥的較好模型。Kim等［12］的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多數(shù)胃癌組織中有HDAC1mRNA和蛋白高表達(dá)，這表明在胃癌組織中組蛋白去乙?；傅谋磉_(dá)增加，而組蛋白的表達(dá)是明顯降低的。親代細(xì)胞SGC－7901與耐藥細(xì)胞SGC－7901／VCR細(xì)胞作為胃癌細(xì)胞系，也具有此特點(diǎn)，因此可以選擇胃癌細(xì)胞作為丙戊酸鹽逆轉(zhuǎn)耐藥的研究對(duì)象。

組蛋白氨基端富含賴氨酸殘基，對(duì)其中保守位點(diǎn)的乙?；揎椏梢杂绊慏NA與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物的結(jié)合，調(diào)控DNA的復(fù)制和修復(fù)、基因表達(dá)、染色質(zhì)組裝和細(xì)胞有絲分裂［13］。組蛋白的乙酰化狀態(tài)由兩類酶來決定，即組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白脫乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）［14］。這兩類酶對(duì)組蛋白乙?；饔谜{(diào)控的失衡，可導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，使調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、凋亡的基因轉(zhuǎn)錄失衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡變。HDACIs作為一類新型、有效的抗腫瘤化合物，可促進(jìn)組蛋白乙?；せ钅承┗蜣D(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯、促進(jìn)細(xì)胞分化和凋亡［15］。丙戊酸鹽作為一種組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitors，HDACIs），與SAHA、TSA 等 HDACIs相比，具有作用時(shí)間長，毒性作用較弱等優(yōu)點(diǎn)［16］。而且本研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸鹽 對(duì) SGC－7901 和 SGC－7901／VCR 細(xì) 胞 的 IC50分 別 為（3.681±0.889）mmol／L和（3.313±0.511）mmol／L，二者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明與SGC－7901相比，SGC－7901／VCR對(duì)丙戊酸鹽的敏感性相同。本研究選取0.5mmol／L和1.0 mmol／L兩個(gè)較低濃度丙戊酸鹽與VCR聯(lián)用，觀察其逆轉(zhuǎn)耐藥效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙戊酸鹽使SGC－7901／VCR細(xì)胞對(duì)VCR的敏感性明顯增加，IC50由（2.433±0.208）mol／L分別降為（0.850±0.132）μmol／L和（0.433±0.104）μmol／L，逆轉(zhuǎn)指數(shù)分別為2.86和5.62。

Keshelava等［17］在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞中組蛋白去乙酰化酶的表達(dá)明顯增加，即乙酰化組蛋白表達(dá)明顯降低。通過抑制HDAC的表達(dá)或降低其活性可增加多藥耐藥細(xì)胞對(duì)普通化療藥物的敏感性。為了探討丙戊酸鹽逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)了親代細(xì)胞和耐藥細(xì)胞中AcH3的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)耐藥細(xì)胞SGC－7901／VCR中AcH3的表達(dá)量明顯低于親代細(xì)胞SGC－7901。丙戊酸鹽單獨(dú)或與VCR聯(lián)用后檢測(cè)結(jié)果顯示VCR不能增加AcH3的表達(dá)，而丙戊酸鹽增加AcH3表達(dá)則具有濃度和時(shí)間依賴性。增加的乙?；M蛋白通過多種途徑殺滅腫瘤細(xì)胞，其中最重要的就是增加細(xì)胞凋亡［18］。因此，本實(shí)驗(yàn)將低濃度丙戊酸鹽和VCR聯(lián)用后流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與未處理組相比，單獨(dú)丙戊酸鹽或VCR處理細(xì)胞均可誘導(dǎo)凋亡但比例較低，而兩藥聯(lián)用時(shí)耐藥細(xì)胞SGC－7901／VCR細(xì)胞的凋亡率明顯增加。因此，丙戊酸鹽通過抑制去乙?；冈黾右阴；M蛋白（如AcH3）的表達(dá)，進(jìn)而通過一系列機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞凋亡逆轉(zhuǎn)耐藥。

目前，許多組蛋白去乙酰化酶抑制劑類藥物進(jìn)入了臨床實(shí)驗(yàn)和一線治療，如 MS－275、他地那蘭、belinostat、vorinostat、帕比司他等，均顯示了較好的抗腫瘤效果［19］。作為一種新型非細(xì)胞毒的廣譜抗腫瘤藥物，HDACi具有良好的臨床應(yīng)用前景和價(jià)值，作為其中的一種，由于丙戊酸鹽作用時(shí)間長、安全范圍大等特點(diǎn)，特別是聯(lián)合其他化療藥物時(shí)對(duì)化療療效的促進(jìn)作用，將會(huì)使其應(yīng)用得到越來越多的重視。

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