侯鈺佩，郭阿麗，翟廣玉#，馬 巖，馬海英，王 鵬，朱 瑋，渠文濤

1)鄭州大學(xué)護(hù)理學(xué)院 鄭州 450052

2)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 鄭州 450007

3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

人體內(nèi)的自由基與多種疾病的發(fā)生有關(guān)[1]。槲皮素是天然的自由基清除劑[2]，具有止咳、平喘、抗炎、抗病毒和抗癌等作用[3]。中藥配位化學(xué)認(rèn)為，中藥的有效成分不單純是有機(jī)分子，也不單純是微量元素，而主要是有機(jī)分子與微量元素組成的配合物。已有研究[4-7]顯示槲皮素可與多種金屬離子螯合形成穩(wěn)定的配合物，并可引起腫瘤細(xì)胞生長受抑或凋亡。該研究中作者合成了槲皮素鍺，并觀察了其對多種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 試劑:槲皮素(自制)，氧化鍺(試劑)，RPMI 1640培養(yǎng)基(HyClone，北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，青霉素、鏈霉素(HyClone，SH40003-12)，胎牛血清(無噬菌體，低內(nèi)毒素，杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，Sigma公司);其他試劑均為分析純。細(xì)胞株:人子宮頸癌細(xì)胞Hela、人肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1、人食管癌細(xì)胞EC9706與人前列腺癌細(xì)胞PC-3購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。儀器:FTS-3000型紅外光譜儀，Perkin-400CHN型元素分析儀，德國耐馳STA 409 PC/PG差熱分析儀，UV-240型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)，CJ-2F超凈工作臺(蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備有限公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國SIM公司)，倒置顯微鏡(德國萊卡公司)，Spectra Mr型全波長酶標(biāo)儀(美國Dynex公司)。

1.2 槲皮素鍺的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[7]的方法適當(dāng)改進(jìn)。取1 mmol槲皮素，1 mmol氧化鍺，加入50 mL甲醇，甲醇鈉調(diào)節(jié)pH為8.5，于裝有磁力攪拌器和冷凝管的三口燒瓶中，加熱回流6 h。用硅膠G板監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程，待反應(yīng)完成時(shí)，停止回流。反應(yīng)液裝入聚酰胺層析柱，先用水沖洗，再用不同濃度的甲醇溶液梯度洗脫，收集設(shè)定區(qū)間洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干有機(jī)溶劑得橘黃色固體，用甲醇重提，得深橘黃色固體。所得固體經(jīng)元素分析，紫外、紅外光譜分析及熱分析鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物后，用滅菌水配制成10 mmol/L的原藥貯存液，4℃保存，臨用時(shí)以RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋，0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.3 槲皮素鍺對 Hela細(xì)胞、SPC-A-1細(xì)胞、EC9706細(xì)胞和PC-3細(xì)胞增殖的影響 分別取處于對數(shù)生長期的上述細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔6×103個(gè)，接種于96孔板中，體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃、飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的槲皮素鍺至終濃度分別為10、100 μmol/L，溶劑對照組加入完全培養(yǎng)基，每孔終體積為200 μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后取出培養(yǎng)板，倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并照相。分別加入5 g/L MTT，20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液后加入DMSO 150 μL/孔，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解后，采用酶標(biāo)儀檢測波長570 nm處各孔光密度值。細(xì)胞增殖抑制率(IR)=1－(藥物組光密度值/對照組光密度值)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較不同濃度槲皮素鍺對4種細(xì)胞IR的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

隨著槲皮素鍺濃度的增加，細(xì)胞體積急劇變小、變形，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞核質(zhì)濃縮或呈碎塊狀。以SPCA-1和EC9706細(xì)胞最為典型，見圖1。不同濃度槲皮素鍺對4種腫瘤細(xì)胞的IR見表1。

圖1 不同濃度槲皮素鍺處理后SPC-A-1細(xì)胞(A)和EC9706細(xì)胞(B)形態(tài)的變化(×200)

表1 不同濃度的槲皮素鍺對4種腫瘤細(xì)胞的IR(n=6) %

3 討論

槲皮素可與許多金屬離子螯合形成穩(wěn)定的配合物[4]。Tan等[5]發(fā)現(xiàn)槲皮素鋅和槲皮素鎳能夠嵌入DNA的堿基對中，使細(xì)胞核皺縮，引起細(xì)胞凋亡。Zhou等[6]發(fā)現(xiàn)槲皮素銅與DNA有相互鍵合作用，可抑制癌細(xì)胞的惡性生長。Ferrer等[7]發(fā)現(xiàn)槲皮素釩具有抗骨腫瘤的作用。鍺是一種具有多種生物活性的微量元素。有機(jī)鍺具有調(diào)節(jié)人體免疫和造血機(jī)能、清除自由基及抗癌等功效[8]。該研究結(jié)果顯示，槲皮素和鍺在堿性條件下，可以生成槲皮素鍺配合物，并通過元素分析，紫外、紅外光譜分析及熱分析鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。MTT實(shí)驗(yàn)證明，合成的槲皮素鍺體外對Hela細(xì)胞、SPC-A-1細(xì)胞、EC9706細(xì)胞和PC-3細(xì)胞的增殖均有抑制作用，以高濃度組作用更為明顯，提示槲皮素鍺具備廣泛的抗腫瘤作用，具有開發(fā)研制為抗腫瘤藥物的可能，其抗腫瘤機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

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