燕學(xué)波，杜運(yùn)華，呂安林，邢玉潔，胡朝暉，胡新君，岳 峰

近幾年自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）移植技術(shù)發(fā)展迅速，逐漸成為治療心肌梗死后心衰的有效辦法之一。Frieden-stein于1966年首先證實(shí)BMMSCs是骨髓基質(zhì)的重要組成成分，在一定條件下能向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化。骨髓是由造血干細(xì)胞和非造血干細(xì)胞組成，BMMSCs是骨髓的非造血干細(xì)胞，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，在體外可被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞等。BMMSCs因取材容易，不涉及倫理問(wèn)題和無(wú)免疫排斥反應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究。但是目前尚未篩選出BMMSCs特征性的表面標(biāo)記分子，因此無(wú)法直接鑒定BMMSCs。目前研究發(fā)現(xiàn)BMMSCs表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等的一些表面標(biāo)志抗原，而不表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志抗原。因此可以通過(guò)檢測(cè)BMMSCs陽(yáng)性和陰性表面標(biāo)志抗原的方法間接鑒定BMMSCs。主要的分離純化方法有全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀篩選和免疫磁珠篩選。但是4種主要分離純化方法各有利弊，為此筆者提出，通過(guò)密度梯度離心法和貼壁法聯(lián)合分離純化BMMSCs，聯(lián)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和檢測(cè)傳代4代的BMMSCs表面陽(yáng)性標(biāo)志抗原CD44和表面陰性標(biāo)志抗原CD45來(lái)鑒定BMMSCs。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡健康Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，體質(zhì)量（120±20） g，SPF 級(jí)，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器 L-DMEM培養(yǎng)液，胰蛋白酶，胎牛血清 （FBS），F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液 （1.077 g/ml），F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗大鼠 CD44，PE標(biāo)記的抗大鼠CD45，超凈工作臺(tái)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，光學(xué)倒置相差顯微鏡，高速室溫離心機(jī)，流式細(xì)胞儀。

1.3 方法

1.3.1 BMMSCs分離、培養(yǎng)及傳代 ①采用頸椎脫臼法處死大鼠，在超凈臺(tái)中用不完全培養(yǎng)液徹底沖洗大鼠骨髓腔，獲取骨髓懸液；用密度為1.077 g/ml的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液離心分離出BMMSCs，加入適量L-DMEM完全培養(yǎng)液 （L-DMEM，10%FBS，300 mg/L L-Gln，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素），充分混勻，重懸、計(jì)數(shù)，以1×106/ml的細(xì)胞密度接種于T25無(wú)菌塑料培養(yǎng)瓶，隨后將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中飽和濕度培養(yǎng)，3 d后首次更換新鮮L-DMEM培養(yǎng)液，去除未貼壁的懸浮細(xì)胞，以后換液1次/3 d，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待原代細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底85%左右時(shí)傳代；②待原代細(xì)胞接近85%融合時(shí)傳代，加入2.5 g/L的胰蛋白酶2～3 ml，將培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞間隙增大，回縮變圓時(shí)，立即棄去胰蛋白酶，加入適量L-DMEM培養(yǎng)液終止消化，按1∶2的比例將細(xì)胞懸液接種于L-DMEM培養(yǎng)基中，第3天首次換液，以后換液1次/3 d，傳代細(xì)胞記為P1，再次傳代細(xì)胞記為P2，培養(yǎng)至第4代，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及表面標(biāo)記抗原鑒定。

1.3.2 BMMSCs的鑒定

1.3.2.1 BMMSCs形態(tài)學(xué)變化 倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并拍照記錄典型細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2.2 流式細(xì)胞儀鑒定 取第4代BMMSCs細(xì)胞，用PBS清洗之后加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液移入離心管中，室溫下1500 r/min，離心 5 min。用 PBS 洗滌 2 次，棄上清，余 50 μl，配成濃度為1×106/ml的細(xì)胞懸液。分別加入FITC標(biāo)記的抗大鼠CD44單抗抗體2.5 μl，PE標(biāo)記的抗大鼠 CD45 單抗抗體 5 μl，4 ℃，避光孵育 30 min。再次用PBS洗滌2次，棄上清液，加入300 μl的PBS，混勻細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將樣本上樣于流式細(xì)胞儀，檢測(cè) FITC標(biāo)記細(xì)胞和PE標(biāo)記細(xì)胞各占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 BMMSCs培養(yǎng)傳代細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 在倒置顯微鏡下，剛接種的BMMSCs呈圓形或球形，體積小，折光性強(qiáng)（圖1a）。3 d后首次換液大部分細(xì)胞貼壁，體積較小，形態(tài)多樣，大部分細(xì)胞為橢圓形、短梭形，也有三角形和/或星形細(xì)胞，且伸出長(zhǎng)短不一、粗細(xì)不等的胞質(zhì)突起互相連接（圖1b）。7 d后，細(xì)胞快速增殖，形成大小不一的細(xì)胞集落，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，體積增大，以長(zhǎng)梭形為主，呈放射狀向四周擴(kuò)展（圖1c）。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，呈長(zhǎng)梭形、旋渦狀生長(zhǎng)，且細(xì)胞形態(tài)均一，趨向一致（圖1d）。

圖1 BMMSCs培養(yǎng)傳代細(xì)胞形態(tài)變化

2.2 BMMSCs表面抗原鑒定結(jié)果 對(duì)傳至第4代的BMMSCs進(jìn)行鑒定，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMMSCs表面抗原CD44和CD45，結(jié)果顯示：BMMSCs CD44陽(yáng)性表達(dá)率為（89.98±1.29）%，CD45陽(yáng)性表達(dá)率為（2.14±0.22）%（圖2）。此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。提示采用聯(lián)合法分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)擴(kuò)增，可以得到純化的BMMSCs。

3 討 論

BMMSCs是骨髓中的非造血干細(xì)胞，主要來(lái)源于中胚層，在骨膜、肌肉和外周組織中均有存在，以骨髓和臍血中含量最多，但也只占骨髓有核細(xì)胞的0.001%～0.01%。因臍血涉及倫理學(xué)問(wèn)題，且不易采取，故從骨髓中分離、純化和擴(kuò)增BMMSCs就顯得非常重要[1，6]。 最初 Friedenstein[7]建立 BMMSCs 的分離方法是利用貼壁法分離得到。但隨著B(niǎo)MMSCs研究的深入，對(duì)細(xì)胞需求增加，快速獲得足夠的BMMSCs是各項(xiàng)研究的基礎(chǔ)。目前比較常用的分離純化方法是貼壁分離法和密度梯度離心法，流式細(xì)胞篩選和免疫磁珠分離法因操作繁瑣，且易損傷細(xì)胞，影響細(xì)胞的生物學(xué)功能而較少使用。

圖2 BMMSCs表面抗原表達(dá)

筆者通過(guò)充分沖洗大鼠骨髓腔獲取最大量骨髓后，用淋巴細(xì)胞分離液通過(guò)密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，然后利用BMMSCs易于貼壁的特點(diǎn)，通過(guò)換液培養(yǎng)去除懸浮不貼壁的細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，懸浮不貼壁的細(xì)胞隨換液而不斷被清除，而B(niǎo)MMSCs因貼壁生長(zhǎng)得以純化。通過(guò)觀察BMMSCs形態(tài)學(xué)變化和流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMMSCs表面陽(yáng)性和陰性標(biāo)志物來(lái)進(jìn)行鑒定。從形態(tài)學(xué)上來(lái)鑒別：骨髓造血干細(xì)胞多呈圓形，而B(niǎo)MMSCs呈細(xì)長(zhǎng)梭形，核大，且在培養(yǎng)傳代過(guò)程中，體積逐漸增大，并形成細(xì)胞集落，排列緊密，走向趨于均勻一致。在分離培養(yǎng)的BMMSCs中，雖然含有部分造血細(xì)胞，但因其不貼壁懸浮在培養(yǎng)液中，在換液時(shí)可以逐步去除，少量造血細(xì)胞也能貼壁，但增殖緩慢，在消化傳代時(shí)脫壁速度比BMMSCs慢，因此通過(guò)消化傳代的方法也可逐漸將其去除，傳至第4代基本可達(dá)到純化目的。

另外一種方法就是通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志抗原間接鑒定BMMSCs。目前研究BMMSCs 表達(dá) CD29、CD44、CD71、CD105、CD166等，而不表達(dá) CD14、CD31、CD34、CD45 等[2-5]。 朱勇等[8]采用直接貼壁法分離培養(yǎng)BMMSCs，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMMSCs表面標(biāo)志抗原CD90、CD45進(jìn)行鑒定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示第3代BMMSCs表面標(biāo)記物CD90和CD45陽(yáng)性表達(dá)率分別為99.8%和6.8%，提示BMMSCs表達(dá)CD90而不表達(dá)CD45。倪玉霞等[9]對(duì)全骨髓貼壁培養(yǎng)法和密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BMMSCs的純度進(jìn)行比較，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原 CD34、CD44、CD45、CD29、CD90及CD11b。結(jié)果顯示兩種方法分離培養(yǎng)的BMMSCs均表達(dá)CD44、CD29和CD90，不表達(dá)CD34、CD45和CD11b。密度梯度離心法分離培養(yǎng)出的BMMSCs較全骨髓貼壁培養(yǎng)法純度高，但全骨髓貼壁培養(yǎng)法能夠縮短原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，提高效率。Zhang等[10]將分離的大鼠BMMSCs利用表面抗原CD54和CD90進(jìn)行免疫磁珠分選，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)可以獲得高表達(dá)CD54和CD90，而不表達(dá)CD45的高純度的BMMSCs。也有研究者采用檢測(cè)細(xì)胞基因的方法來(lái)鑒定BMMSCs[11]。

筆者選擇檢測(cè)BMMSCs陽(yáng)性標(biāo)志抗原CD44和陰性標(biāo)志抗原CD45相結(jié)合的方式進(jìn)行鑒定，其結(jié)果顯示BMMSCs CD44陽(yáng)性表達(dá)率為 （89.98±1.29）%，CD45陽(yáng)性表達(dá)率為（2.14±0.22）%。 此結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。提示采用密度梯度離心法和貼壁分離法聯(lián)合分離純化大鼠BMMSCs，經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)擴(kuò)增，可以得到純化的BMMSCs。

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