楊 柳，周月琴，張 敏

（重慶市急救醫(yī)療中心神經(jīng)內(nèi)科 400014）

癲癇是一組以反復(fù)發(fā)作的腦功能失常（神經(jīng)元異常放電）為特征的慢性腦部疾病，全球約有5 000萬左右的癲癇患者［1］?？拱d癇治療后，70%～75%癲癇患者的病情可得到控制，但有25%～30%的患者產(chǎn)生耐藥，耐藥性癲癇嚴(yán)重危害人類健康。鋅離子（Zn2＋）存在于人體所有細(xì)胞，為生命所必需，是人體100多種酶的組成部分，鋅指結(jié)構(gòu)是由肽鏈中氨基酸殘基的特征基團(tuán)與Zn2＋結(jié)合形成的一種很短的、可自我折疊成“手指”形狀的多肽空間構(gòu)型，具有該結(jié)構(gòu)的蛋白多參與基因表達(dá)的調(diào)控、細(xì)胞分化及胚胎發(fā)育等過程。Zn2＋主要分布在海馬齒狀回，尤其在苔蘚纖維突觸囊泡內(nèi)分布較多［2］。許多研究表明，Zn2＋含量的異常與癲癇的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［3－4］，但目前關(guān)于Zn2＋和耐藥性癲癇的研究報道較少。本課題采用高通量研究方法尋找Zn2＋相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律，以探討耐藥性癲癇的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2002年至2004年在重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)天壇醫(yī)院、北京宣武醫(yī)院、衛(wèi)生部北京醫(yī)院及第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院就治的患者。將48例接受手術(shù)治療的耐藥性癲癇患者作為耐藥性癲癇組，其中，男25例，女23例；平均年齡（24.10±9.13）歲；部分發(fā)作繼發(fā)全身性強(qiáng)直－陣攣發(fā)作34例，復(fù)雜部分性發(fā)作13例，單純部分性發(fā)作1例。對照組8例，其中，男2例，女6例；平均年齡（25.89±13.56）歲；2例為意外死亡后按相關(guān)規(guī)定進(jìn)行尸檢者，6例為接受顱內(nèi)減壓術(shù)患者。

1.2 入組條件 耐藥性癲癇組入組條件：（1）具有癲癇發(fā)作的典型表現(xiàn)和腦電圖特征；正規(guī)服用過3種或以上一線抗癲癇藥（如苯妥英鈉、卡馬西平、丙戊酸鎂、苯巴比妥等）；除服用丙戊酸鎂外，患者的血藥濃度維持在正常高線；與發(fā)作前基線比較，服藥后發(fā)作頻率無明顯減少。（2）無明確病因，體格檢查提示無局灶性神經(jīng)系統(tǒng)體征，或雖有體征但與癲癇發(fā)作無關(guān)；術(shù)后腦組織檢查未發(fā)現(xiàn)能引起癲癇發(fā)作的病因。（3）頭顱CT或磁共振成像檢查除提示海馬硬化外，無其他異常。（4）患者的發(fā)作類型符合國際抗癲癇聯(lián)盟1981年有關(guān)癲癇發(fā)作類型分類的規(guī)定。（5）手術(shù)前1周放置硬膜下電極，術(shù)中用皮質(zhì)電極進(jìn)行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)有明確且固定的癲癇放電部位，有手術(shù)適應(yīng)證，且能進(jìn)行手術(shù)者。對照組入組條件：（1）無中樞神經(jīng)系統(tǒng)病史；（2）尸檢未發(fā)現(xiàn)腦組織有能夠引起癲癇發(fā)作的結(jié)構(gòu)和功能損傷，取材與死亡的時間間隔小于5h。上述患者均獲得家屬同意，并簽署知情同意書。

1.3 樣本采集 耐藥性癲癇組患者在手術(shù)中取顳葉組織待檢，對照組尸檢及手術(shù)患者的取材部位為顳葉組織。組織樣本采集后立即放入液氮（－196℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 高通量基因芯片差異表達(dá)譜分析 由上海博星基因芯片有限責(zé)任公司進(jìn)行芯片制備，將耐藥性癲癇組及對照組樣本總RNA配對，進(jìn)行探針標(biāo)記［芯片分別編號：芯片1（人H40s）、芯片2（人 H40s）、芯片3（人 H140s）］。用ScanArray 4000掃描儀掃描芯片，以GenePix Pro 3.0圖像處理軟件分析Cy3、Cy5兩種熒光信號的強(qiáng)度和比值。篩選出Cy3、Cy5信號強(qiáng)度值均大于200的基因點(diǎn)，并將Cy5／Cy3比值大于2的基因點(diǎn)的基因作為差異表達(dá)基因。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.5 引物合成及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptasepolymerase chain reaction，RT－PCR） 根據(jù) Genebank中基因的mRNA和DNA序列，引物的設(shè)計和合成都由Introvegen公司完成，引物序列見表1。按常規(guī)步驟使用BIOZOL試劑提取總RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，操作參照TaKaLa產(chǎn)品說明書（大連寶生物工程有限公司），反應(yīng)產(chǎn)物于－20℃保存。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，94°變性30s，55～60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，采用Bio－rad凝膠成像系統(tǒng)軟件分析電泳條帶，分別檢測TNF受體相關(guān)因子（TNF receptor associated factor，TRAF）3、Ring和YY1結(jié)合蛋白（ring and YY1binding protein，RYBP）、CCR4－NOT轉(zhuǎn)錄復(fù)合體亞基4（CCR4－NOT transcription complex，subunit 4，CNOT4）、核受體4A2（nuclear receptor subfamily 4，group A，member 2，NR4A2）、β－actin－f、β－actin－s mRNA 的光密度值，目的基因的相對光密度＝目的基因光密度值÷β－actin光密度值。

表1 目的基因的引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用單因素t檢驗(yàn)，單因素分析有顯著性差異的指標(biāo)，將其作為自變量進(jìn)行多元線性回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA的抽提以及質(zhì)控 耐藥性癲癇組和對照組腦組織樣本的總 RNA濃度分別為154.37μg／mL及167.21μg／mL。兩組樣本采用紫外分光光度計檢測光密度（optical density，OD）值，其 OD260／OD280分別為1.834和1.908，均介于1.7～2.2；電泳結(jié)果顯示RNA條帶清晰，提示樣本的總RNA質(zhì)量合格，見圖1。

2.2 基因芯片和RT－PCR結(jié)果 掃描的4 097條人類基因，耐藥性癲癇組與對照組共有451條基因表達(dá)有差異，其中耐藥性癲癇組患者腦組織中基因表達(dá)上調(diào)的有291條，下調(diào)的有160條，其中TRAF3、RYBP、CNOT4和NR4A2這4種與鋅結(jié)合相關(guān)的基因在耐藥性癲癇組患者腦組織中的表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng)（P＜0.01），其Cy5／Cy3比值分別為2.451、2.228、2.516及2.445。RT－PCR的結(jié)果與芯片表達(dá)譜分析結(jié)果一致。耐藥性癲癇組患者腦組織中TRAF3、RYBP、CNOT4和NR4A2基因的相對光密度分別為0.47±0.12、0.35±0.13、0.58±0.11及0.41±0.20，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2、3。

圖1 總RNA電泳圖

圖2 耐藥性癲癇和對照組患者腦組織中TRAF3、RYBP、CNOT4和NR4A2mRNA的表達(dá)

圖3 耐藥性癲癇和對照組患者腦組織中TRAF3、RYBP、CNOT4和NR4A2mRNA表達(dá)的相對光密度值比較

3 討 論

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病。癲癇發(fā)病機(jī)制的研究一直是國際神經(jīng)科學(xué)研究的前沿，借助分子生物學(xué)、神經(jīng)藥理學(xué)、腦影像學(xué)、神經(jīng)行為學(xué)以及基因工程動物模型等研究手段，人類在癲癇研究的許多方面取得了顯著成績，然而癲癇的發(fā)病機(jī)制難以完全歸因于某一分子事件和基因的改變，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)自身穩(wěn)態(tài)的破壞、異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成以及環(huán)境因素對癲癇的發(fā)生、發(fā)展都起著重要作用。

大通量檢測基因表達(dá)的芯片技術(shù)成為研究癲癇發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的重要手段，利用其可同時對成千上萬基因進(jìn)行同步檢測的功能，使人們能夠綜合分析不同個體、組織的不同發(fā)育階段的病變特征，高通量地研究基因功能，揭示疾病的發(fā)生機(jī)制，具有高效、快速及同步分析生物信息的特點(diǎn)。本課題利用基因芯片技術(shù)同步檢測耐藥性癲癇患者腦組織中4 097條基因表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)有451條基因表達(dá)異常，TRAF3、RYBP、CNOT4和NR4A2這4種與Zn2＋結(jié)合相關(guān)的基因在耐藥性癲癇組患者腦組織中的表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng)，采用RT－PCR擴(kuò)增證實(shí)這些差異表達(dá)基因的存在，說明耐藥性癲癇患者腦組織中確實(shí)存在Zn2＋相關(guān)基因的異常表達(dá)。

耐藥性癲癇，又稱難治性癲癇，是指臨床上經(jīng)合理使用多種抗癲癇藥物治療后，抗癲癇藥物的血藥濃度已達(dá)到患者的最大耐受劑量，但癲癇發(fā)作仍不能得到有效控制的癲癇。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大約有70%難治性癲癇為顳葉癲癇，顳葉癲癇最顯著的臨床特征是長期反復(fù)出現(xiàn)的自發(fā)性癲癇發(fā)作，顳葉癲癇患者腦組織出現(xiàn)明顯病理改變，伴隨不同臨床和腦電圖表現(xiàn)，顳葉癲癇患者對大部分抗癲癇藥物產(chǎn)生了耐藥性［5］。

人們發(fā)現(xiàn)Zn2＋在腦組織內(nèi)的分布主要集中在海馬、顳葉、皮層和杏仁核，這與耐藥性癲癇的好發(fā)部位基本一致。Bitanihirwe和Cunningham［3］向大鼠腦組織內(nèi)注射小劑量Zn2＋后，引起大鼠跳躍、奔跑、強(qiáng)直陣攣性抽搐；Pei和Kouama［6］通過在兔子海馬內(nèi)注射硫酸鋅，成功建立了陣攣和繼發(fā)性癲癇發(fā)作模型；還有研究發(fā)現(xiàn)，某些癲癇患者腦組織的Zn2＋濃度明顯高于正常人［7－8］。這些研究提示Zn2＋與癲癇發(fā)作密切相關(guān)。本研究旨在從基因角度揭示Zn2＋與耐藥性癲癇的關(guān)系。

盡管Zn2＋與癲癇發(fā)作關(guān)系的機(jī)制還不清楚，然而，目前的研究 發(fā) 現(xiàn) Zn2＋可 抑 制 γ－氨 基 丁 酸 （γ－aminobutyric acid，GABA）轉(zhuǎn)運(yùn)體活性，GABA能清除突觸間隙內(nèi)的GABA，而突觸內(nèi)存在大量GABA，使突觸后GABA受體易被激活而發(fā)揮抑制作用。在神經(jīng)元興奮情況下，Zn2＋濃度升高，可通過抑制N－甲基－D－天冬酰胺受體而降低神經(jīng)元興奮性；同時，通過增加GABA數(shù)量來增強(qiáng)其抑制作用［9］。

Zn2＋還可影響電壓門控離子通道的閉合。研究發(fā)現(xiàn)，Zn2＋是 Na＋－K＋－ATP酶的競爭性抑制劑，可顯著抑制 Na＋－K＋－ATP酶活性，使細(xì)胞膜的離子梯度受到破壞而失去穩(wěn)定性，出現(xiàn)過度興奮狀態(tài)，導(dǎo)致癲癇發(fā)作［10］。

另外，Zn2＋誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡也是其誘導(dǎo)癲癇發(fā)作的一個重要因素［11］。組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在癲癇狀態(tài)下，神經(jīng)纖維內(nèi)的Zn2＋濃度明顯減少（以苔蘚纖維通路最為顯著），而在受損的海馬CA3、CA1區(qū)錐體細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量Zn2＋聚集，細(xì)胞內(nèi)Zn2＋聚集量與神經(jīng)元受損程度明顯正相關(guān)。Yokoyama等［12］認(rèn)為30μmol／L Zn2＋可使體外培養(yǎng)的神經(jīng)元死亡。

研究發(fā)現(xiàn)耐藥性癲癇可能的發(fā)病機(jī)制包括細(xì)胞能量代謝障礙、神經(jīng)元凋亡、皮層發(fā)育異常和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建［13－14］。在各種原因?qū)е碌哪退幮园d癇患者的腦組織中均存在神經(jīng)元的凋亡，而越來越多的研究證實(shí)細(xì)胞內(nèi)Zn2＋濃度的動態(tài)平衡與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。在臨界值以下，Zn2＋水平增加，可預(yù)防或改善與細(xì)胞凋亡有關(guān)的細(xì)胞退行性變，而超過臨界值，Zn2＋水平的增加，則可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是促進(jìn)反應(yīng)性氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生和積聚，激活自殺相關(guān)因子（factor associated suicide，F(xiàn)AS）配體途徑、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）α及細(xì)胞色素C介導(dǎo)的Caspase－3活化途徑，直接或間接激活細(xì)胞的凋亡［15－16］。本研究發(fā)現(xiàn)在耐藥性癲癇患者腦組織中，與Zn2＋代謝相關(guān)的基因表達(dá)異常，推測Zn2＋異常導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡可能參與了耐藥性癲癇的發(fā)生、發(fā)展。

Zn2＋代謝受到多種因素的調(diào)節(jié)。TRAF3屬于TRAF超家族中的重要一員，是存在于細(xì)胞質(zhì)的重要接頭分子，它一方面接收外來刺激信號，另一方面又通過其TRAF同源結(jié)構(gòu)域募集細(xì)胞質(zhì)內(nèi)其他含有TRAF結(jié)構(gòu)域的蛋白分子傳遞信號。近年來，人們發(fā)現(xiàn)TRAF在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著兩種截然不同的作用，它既是核因子kappa B通路的負(fù)向調(diào)控因子［17］，又是正向調(diào)控I型干擾素產(chǎn)物的關(guān)鍵因子［18］，二者都在先天和后天免疫中發(fā)揮重要作用。RYBP是一種多肽梳齒蛋白，它可通過與轉(zhuǎn)錄因子及多肽梳齒蛋白產(chǎn)物的結(jié)合，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮重要作用［19］。保守的CNOT4對于多種細(xì)胞功能具有重要作用，它參與mRNA調(diào)控［20］、蛋白泛素化／降解［21］及組氨酸甲基化等過程［22］。NR4A2在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過程中也發(fā)揮關(guān)鍵作用，它在調(diào)節(jié)血糖和血脂平衡、脂肪細(xì)胞分化、炎癥及血管重建等方面發(fā)揮重要作用［23］。上述4個蛋白均屬鋅指蛋白，都含有與Zn2＋結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，能夠直接或間接影響Zn2＋的結(jié)合［17，24］，并都參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡。有研究認(rèn)為同屬于鋅指蛋白家族的NHLRC1（NHL repeat containing 1）［25］、鋅指結(jié)構(gòu)同源盒1B（zinc finger homeobox 1b，ZFHX1B）［26］、植物同源結(jié)構(gòu)域指蛋白 6［plant homeodomain（PHD）－like finger 6，PHF6］等基因與癲癇也有著密切的聯(lián)系［27］，因此推測 與Zn2＋結(jié) 合相 關(guān) 的TRAF3、RYBP、CNOT4和NR4A2基因也參與了癲癇的發(fā)生、發(fā)展。

目前對Zn2＋結(jié)合相關(guān)基因的研究剛剛開始，在本研究中，基因芯片和RT－PCR檢測結(jié)果提示耐藥性癲癇患者腦組織中與Zn2＋結(jié)合相關(guān)的4種基因有明顯的異常表達(dá)，這從一個新的角度對耐藥性癲癇的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了初步探討，但它們是否在蛋白質(zhì)水平上也存在表達(dá)異常，其內(nèi)在機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

［1］ de Boer HM，Mula M，Sander JW.The global burden and stigma of epilepsy［J］.Epilepsy Behav，2008，12（4）：540－546.

［2］ Mitsuya K，Nitta N，Suzuki F.Persistent zinc depletion in the mossy fiber terminals in the intrahippocampal kainate mouse model of mesial temporal lobe epilepsy［J］.Epilepsia，2009，50（8）：1979－1990.

［3］ Bitanihirwe BK，Cunningham MG.Zinc：the brain′s dark horse［J］.Synapse，2009，63（11）：1029－1049.

［4］ Elsas SM，Hazany S，Gregory WL，et al.Hippocampal zinc infusion delays the development of afterdischarges and seizures in a kindling model of epilepsy［J］.Epilepsia，2009，50（4）：870－879.

［5］ Xi ZQ，Xiao F，Yuan J，et al.Gene expression analysis on anterior temporal neocortex of patients with intractable epilepsy［J］.Synapse，2009，63（11）：1017－1028.

［6］ Pei YQ，Koyama I.Features of seizures and behavioral changes induced by intrahippocampal injection of zinc sulfate in the rabbit：a new experimental model of epilepsy［J］.Epilepsia，1986，27（3）：183－188.

［7］ Hamed SA，Abdellah MM，El－Melegy N.Blood levels of trace elements，electrolytes，and oxidative stress／antioxi－dant systems in epileptic patients［J］.J Pharmacol Sci，2004，96（4）：465－473.

［8］ Armutcu F，Ozerol E，Gurel A，et al.Effect of long－term therapy with sodium valproate on nail and serum trace element status in epileptic children［J］.Biol Trace Elem Res，2004，102（1／3）：1－10.

［9］ Cohen－Kfir E，Lee W，Eskandari S，et al.Zinc inhibition of gamma－aminobutyric acid transporter 4（GAT4）reveals a link between excitatory and inhibitory neurotransmission［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（17）：6154－6159.

［10］Ribeiro MG，Pedrenho AR，Hassón－Voloch A.Electrocyte（Na（＋），K（＋））ATPase inhibition induced by zinc is reverted by dithiothreitol［J］.Int J Biochem Cell Biol，2002，34（5）：516－524.

［11］Koh JY，Suh SW，Gwag BJ，et al.The role of zinc in selective neuronal death after transient global cerebral ischemia［J］.Science，1996，272（5264）：1013－1016.

［12］Yokoyama M，Koh J，Choi DW.Brief exposure to zinc is toxic to cortical neurons［J］.Neurosci Lett，1986，71（3）：351－355.

［13］Bilevicius E，Yasuda CL，Silva MS，et al.Antiepileptic drug response in temporal lobe epilepsy：a clinical and MRI morphometry study［J］.Neurology，2010，75（19）：1695－1701.

［14］Wang L，Liu G，He M，et al.Increased insulin receptor expression in anterior temporal neocortex of patients with intractable epilepsy［J］.J Neurol Sci，2010，296（1／2）：64－68.

［15］Truong－Tran AQ，Carter J，Ruffin RE，et al.The role of zinc in caspase activation and apoptotic cell death［J］.Biometals，2001，14（3／4）：315－330.

［16］Zhou Z，Wang L，Song Z，et al.Zinc supplementation prevents alcoholic liver injury in mice through attenuation of oxidative stress［J］.Am J Pathol，2005，166（6）：1681－1690.

［17］Hauer J，Püschner S，Ramakrishnan P，et al.TNF receptor（TNFR）－associated factor（TRAF）3serves as an inhibitor of TRAF2／5－mediated activation of the noncanonical NF－kappaB pathway by TRAF－binding TNFRs［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102（8）：2874－2879.

［18］Mao AP，Li S，Zhong B，et al.Virus－triggered ubiquitination of TRAF3／6by cIAP1／2is essential for induction of interferon－beta（IFN－beta）and cellular antiviral response［J］.J Biol Chem，2010，285（13）：9470－9476.

［19］Pirity MK，Wang WL，Wolf LV，et al.Rybp，apolycomb complex－associated protein，is required for mouse eye development［J］.BMC Dev Biol，2007，7：39.

［20］Collart MA，Timmers HT.The eukaryotic Ccr4－not complex：a regulatory platform integrating mRNA metabolism with cellular signaling pathways［J］.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，2004，77：289－322.

［21］Albert TK，Hanzawa H，Legtenberg YI，et al.Identification of a ubiquitin－protein ligase subunit within the CCR4－NOT transcription repressor complex［J］.EMBO J，2002，21（3）：355－364.

［22］Mulder KW，Brenkman AB，Inagaki A，et al.Regulation of histone H3K4tri－methylation and PAF complex recruitment by the Ccr4－Not complex［J］.Nucleic Acids Res，2007，35（7）：2428－2439.

［23］Zhao Y，Bruemmer D.NR4Aorphan nuclear receptors：transcriptional regulators of gene expression in metabolism and vascular biology［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30（8）：1535－1541.

［24］Neira JL，Román－Trufero M，Contreras LM，et al.The transcriptional repressor RYBP is a natively unfolded protein which folds upon binding to DNA［J］.Biochemistry，2009，48（6）：1348－1360.

［25］Ianzano L，Zhang J，Chan EM，et al.Lafora progressive Myoclonus Epilepsy mutation database－EPM2Aand NHLRC1（EPM2B）genes［J］.Hum Mutat，2005，26（4）：397.

［26］Espinosa－Parrilla Y，Encha－Razavi F，Attié－Bitach T，et al.Molecular screening of the ZFHX1Bgene in prenatally diagnosed isolated agenesis of the corpus callosum［J］.Prenat Diagn，2004，24（4）：298－301.

［27］Lower KM，Turner G，Kerr BA，et al.Mutations in PHF6 are associated with B?rjeson－Forssman－Lehmann syndrome［J］.Nat Genet，2002，32（4）：661－665.