張宏方 周雪寧 吳 芳 肖迎聰 環(huán) 誠 張怡敏 張程斐 劉啟玲

(陜西中醫(yī)學(xué)院分子病理學(xué)研究室，陜西 咸陽 712046)

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)2010級本科生，廣西 南寧 530001

許多腫瘤的分化、生長失控與其細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)因子密切相關(guān)，尤其是肺癌對人類的健康危害顯得更為嚴(yán)重。研究表明腫瘤細(xì)胞無限增殖失控主要是其抑制凋亡的bcl-2基因及促進(jìn)凋亡的bax基因失調(diào)而導(dǎo)致［1］。我們以前的研究表明，調(diào)衡方有較明顯的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，且可明顯減少轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大?。?-4］。調(diào)衡方抗腫瘤轉(zhuǎn)移是否與 bax、bcl-2凋亡相關(guān)基因有關(guān)，仍未揭示清楚［2-4］。本研究以Lewis肺癌細(xì)胞內(nèi)bax、bcl-2為對象，探討調(diào)衡方含藥血清對Lewis肺癌細(xì)胞內(nèi)bax及bcl-2的影響，從而揭示調(diào)衡方對Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 溴化四唑藍(lán)(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品;Trizol為美國 Amresco公司產(chǎn)品;bax、bcl-2、β-actin的PCR引物均由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成，總RNA提取試劑盒(RNAfast200)購自上海飛捷生物科技有限公司。cDNA第一條鏈合成試劑盒(First Strand cDNA Synthesis Kit)、實(shí)時定量試劑盒(SYBR Green-ROX qPCR Master Mix)均購自Fermentas(立陶宛)。二甲亞砜(DMSO)、胰酶(1∶250)(美國 Sigma 公司);RPMI-1640(Gibico)和胎牛血清(美國Hyclone公司)。細(xì)胞周期DNA含量檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.1.2 儀器 全自動酶標(biāo)儀(美國 Bio-Tek ELX808IU);實(shí)時定量PCR儀(美國 Bio-Rad IQ5.0);全自動高壓滅菌器(日本三洋MLS-3780);倒置顯微鏡(奧特BDS-200);流式細(xì)胞儀(美國 Beckman CELL LAB QUANTA SC);CO2培養(yǎng)箱(美國Napco公司);超低溫冰箱(美國熱電702型)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體(SPF)雌性SD大鼠32只，二級，體質(zhì)量(200±20)g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號：SCXK(陜)2007-001，置本室二級動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.1.4 細(xì)胞株 Lewis肺癌株購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.5 藥品 調(diào)衡方是由生黃芪、生山藥、白花舌蛇草、西洋參、天花粉、莪術(shù)、生雞內(nèi)金、天門冬、水蛭等組成，諸藥均經(jīng)過生藥學(xué)鑒定，符合《中華人民共和國藥典》(95年版)規(guī)定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。將上述藥物經(jīng)煎藥濃縮制取(每1 mL含生藥3 g)，分裝滅菌備用。AG490購自美國 Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含藥血清的制備 將SD大鼠32只隨機(jī)分為調(diào)衡方大、中、小劑量含藥血清組及正常血清組(各組給藥劑量相當(dāng)于臨床等效劑量，依據(jù)文獻(xiàn)［5-7］方法計算人鼠等效劑量及制備含藥血清)，每組各8只，給藥劑量分別為32、18、9 g/kg及灌服等容積的0.9%氯化鈉注射液，分2次給予，連續(xù)給藥5 d，末次灌胃后禁食12 h，但不禁水，再給1 d的量，1 h后，用10%水合氯醛腹腔麻醉，心臟內(nèi)采血，血液靜置后2 500 r/min離心后取血清，56℃水浴30 min滅活，用0.45 μm微孔濾膜過濾除菌(在超凈工作臺上)，分裝于1.5 mL EP 管，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?］。

1.2.2 MTT法檢測調(diào)衡方對Lewis肺癌細(xì)胞生長的抑制作用 將Lewis肺癌細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，傳代至96孔板中，共5組，即調(diào)衡方含藥血清大、中、小劑量組、調(diào)衡方中劑量含藥血清+AG490溶液(25 μmol/L)組及正常血清組，每組設(shè)6個復(fù)孔，每孔接種1×104～2×104個Lewis肺癌細(xì)胞100 μL，另加100 μL核酸內(nèi)切酶A(培養(yǎng)基，在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞會合率達(dá)80% 時，分別加入不同濃度調(diào)衡方含藥血清10 μL及調(diào)衡方中劑量含藥血清+AG490溶液(25 μmol/L)，各孔加培養(yǎng)液至200 μL，還設(shè)只加培養(yǎng)液200 μL的空白孔與只加Lewis肺癌細(xì)胞懸液200 μL的對照孔(各種濃度均為6平行孔)。分別在24、48、72 h時取出1板，每孔再加5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄各孔內(nèi)液體，每孔加入 DMSO 100 μL，振蕩 10 min，以 490 nm 為測定波長，630 nm為參比波長在全自動酶標(biāo)檢測儀上測各孔吸光度值(OD值)。根據(jù)細(xì)胞生長抑制率公式：生長抑制率=(對照組 OD值 -用藥組 OD值)/對照組 OD值 ×100%，計算抑制率［9］。重復(fù)此實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期與凋亡狀況 取對數(shù)生長期Lewis肺癌細(xì)胞，將培養(yǎng)液換成不同濃度的調(diào)衡方含藥血清溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取不同濃度的調(diào)衡方含藥血清液24 h干預(yù)的Lewis肺癌細(xì)胞，同時設(shè)立陰性對照組，并用胰酶消化各組貼壁的Lewis肺癌細(xì)胞，且各組細(xì)胞收集好，在1 500 r/min離心5 min的條件下，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌Lewis肺癌細(xì)胞1次，調(diào)整Lewis肺癌細(xì)胞為1×106/mL的濃度。各組細(xì)胞液用70%乙醇固定且4℃存放，染色前用PBS洗去固定液，加100 μL核酸內(nèi)切酶(RNase A)，37℃水浴中置30 min。再加 PI 400 μL混勻染色且于4℃避光30 min后上機(jī)檢測(記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光)。各組樣品行DNA單參數(shù)含量分析(獲得2.0×104個細(xì)胞樣品)其 DNA含量。用軟件CellquestTM獲取數(shù)據(jù)，用軟件ModfitLT作圖并分析數(shù)據(jù)，測量凋亡的標(biāo)準(zhǔn)用定量亞二倍體峰。

1.2.4 RT-PCR 檢測 bcl-2、bax mRNA 的表達(dá)

1.2.4.1 提取總RNA(用 RNAfast 200) 將不同濃度的調(diào)衡方含藥血清24 h干預(yù)的Lewis肺癌細(xì)胞收集好，在培養(yǎng)皿中用1 mL裂解液裂解細(xì)胞后移至EP中，置室溫5 min且加氯仿200 μL混勻后，再置室溫5 min且4℃離心(12 000 g離心15 min)，轉(zhuǎn)移上層約400 μL水相放置于純化柱的內(nèi)套管中，12 000 g離心1 min，棄去外套管中液體，加500 μL 75%的乙醇(DEPC：焦碳酸二酯處理并高溫滅菌的H2O配制)于內(nèi)套管中，12 000 g離心1 min，再次離心1 min，棄去外套管，換1個干凈的EP管套在內(nèi)套管上，在內(nèi)套管的膜中央加洗脫提取液30 μL，在4℃放置5 min后，13 500 g離心1 min收集提取的總RNA。

1.2.4.2 兩步法實(shí)時 PCR逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 在0.2 mL PCR管中，加入總RNA 1 μg，補(bǔ)充適量的DEPC H2O使總體積達(dá) 11 μL。再加 10 μM Oligo(dT)12-18 1 μL，輕輕混勻、離心。65℃加變性5 min，立即將PCR管插入冰浴中冷卻2 min。然后依次加入下列成分：5 ×PCR buffer 4 μL，RNA酶抑制劑 1 μL，10 mM dNTPmix 2 μL，M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL，混勻瞬時離心，25 ℃，5 min，44 ℃，60 min，于70℃加熱5 min以終止反應(yīng)，cDNA-20℃短期保存或者-70℃長期保存?zhèn)溆?。?步PCR反應(yīng)：bcl-2 上游引物：5'-CGGGAGAACAGGGTATGATAAC-3'，下游5'-GGCTGGAAGGAGAAGATGC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為147 bp。bax上游引物：5'-TGCTACAGGGTTTCATCC-3'，下游 5'-CCAGTTCATCTCCAATTCG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為135 bp。actin上游引物序列：5'-ACCACACCTTCTACAATGAG-3'，下游 5'-ACGACCAGAGGCATACAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為182 bp。25 μL的總體積(加入2 ×Syber Green預(yù)混Taq酶12.5 μL，加上下游引物至終濃度0.2 μmol/L，加入第 1 步反應(yīng)得到的 cDNA 模板 1 μL，以DEPC H2O補(bǔ)足至25 μL，混勻)。每個樣品做2組副孔，實(shí)時上機(jī)檢測。擴(kuò)增條件：第1步，50℃ 2 min;第2步，95 ℃ 10 min; 第3 步，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，收集熒光信號，在該階段擴(kuò)增40個循環(huán);第4步，做溶解曲線。經(jīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證，各個產(chǎn)物的擴(kuò)增效率以目標(biāo)基因與β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物的雙Delta-CT比值分析計算各個組的表達(dá)情況。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 抑制Lewis肺癌細(xì)胞生長的增殖作用 不同劑量調(diào)衡方含藥血清干預(yù)的Lewis肺癌細(xì)胞24、48、72 h后，對Lewis肺癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用，且隨著調(diào)衡方含藥血清藥物劑量的增加，Lewis肺癌細(xì)胞增殖抑制率亦增大(呈現(xiàn)出時間及濃度的依賴性)。提示調(diào)衡方含藥血清對Lewis肺癌細(xì)胞增殖有抑制作用。見圖1。

2.2 調(diào)衡方對Lewis肺癌細(xì)胞周期與凋亡的影響 見表1。

表1 調(diào)衡方對Lewis肺癌細(xì)胞周期與凋亡的影響%，±s

表1 調(diào)衡方對Lewis肺癌細(xì)胞周期與凋亡的影響%，±s

與正常血清組比較，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

組 別 藥物濃度(g/kg) G0期/G1期 G2期/M期 S期 凋亡率正常血清組48.86 ±1.77 9.82 ±0.91 39.32 ±2.27 1.23 ±0.21小劑量血清組 9 53.30 ±1.75 9.85 ±1.25 36.85 ±2.47 2.57 ±0.68中劑量血清組 18 55.31 ±0.96* 12.13 ±1.15 32.56 ±2.46* 8.97 ±1.27＊＊大劑量血清組 32 55.64 ±0.44＊＊ 12.96 ±1.52 31.40 ±0.93* 9.63 ±1.00＊＊中劑量血清 +AG490組 (18+25) μmol/L 59.36±0.41＊＊ 13.16±1.56 27.48±1.04＊＊ 10.10±0.63-＊＊

由表1可見，不同濃度的調(diào)衡方含藥血清干預(yù)Lewis肺癌細(xì)胞24 h后，其細(xì)胞凋亡率隨調(diào)衡方含藥血清藥物濃度的遞增而增加，且除小劑血清組外，調(diào)衡方含藥血清干預(yù)組與正常血清組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，尤其是中劑量含藥血清+AG490組作用非常顯著;而調(diào)衡方含藥血清對Lewis肺癌細(xì)胞周期的影響亦是隨調(diào)衡方含藥血清藥物濃度的增加，肺癌細(xì)胞S期減少或被阻滯(P＜0.05，P ＜0.01)，G0/G1 期有所延長(P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.3 調(diào)衡方對Lewis肺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax mRNA的影響 見表2。

表2 調(diào)衡方對Lewis肺癌細(xì)胞凋亡調(diào)控基因bcl-2及bax mRNA的影響 ±s

表2 調(diào)衡方對Lewis肺癌細(xì)胞凋亡調(diào)控基因bcl-2及bax mRNA的影響 ±s

與正常血清組比較，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

組 別 藥物濃度(g/kg) bcl-2/β-actin bax/β-actin bax/bcl-2正常血清組0.979 ±0.036 0.778 ±0.030 1.259 ±0.014小劑量血清組 9 0.972 ±0.004 0.916 ±0.064 1.066 ±0.086*中劑量血清組 18 0.792 ±0.038* 0.97 ±0.042* 0.816 ±0.007＊＊大劑量血清組 32 0.705±0.034＊＊ 0.985±0.030＊＊ 0.715±0.016＊＊中劑量血清 +AG490組 (18+25)μmol/L 0.662±0.039＊＊ 0.988±0.001＊＊ 0.672±0.048-＊＊

由表2可見，不同濃度的調(diào)衡方含藥血清干預(yù)Lewis肺癌細(xì)胞24 h后，bcl-2 mRNA的表達(dá)量隨著藥物濃度遞加均有明顯下降，而bax mRNA的表達(dá)量呈上升趨勢，除小劑量血清組外，其余各組與正常血清組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。尤其是中劑量血清 +AG490組bcl-2 mRNA表達(dá)降低、bax mRNA表達(dá)上升更為顯著(P＜0.01)，說明調(diào)衡方與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)特異性抑制劑AG490聯(lián)合有相加作用。

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方制劑是中醫(yī)治療腫瘤的重要手段，許多中藥及其復(fù)方能提高機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)放化療效果和減輕放化療的不良反應(yīng)［2，10］，甚至某些中藥可直接抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞，因而中藥及其復(fù)方抗腫瘤具有獨(dú)特優(yōu)勢。bcl-2、bax是細(xì)胞內(nèi)一對與凋亡密切相關(guān)的基因，bcl-2為抑制凋亡的基因，而bax為凋亡促進(jìn)基因。bcl-2激活后通過細(xì)胞內(nèi)一系列的天冬氨酸特異性的半胱氨酸酶的活化直接或間接抑制細(xì)胞的凋亡［11］。胞內(nèi)的bax蛋白表達(dá)增加而促使細(xì)胞凋亡。若在細(xì)胞內(nèi)的bax/bcl-2比值增加，使細(xì)胞內(nèi)的線粒體發(fā)生一系列變化，最終導(dǎo)致Caspase級聯(lián)反應(yīng)［8，12-13］，而促使細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)用調(diào)衡方含藥血清干預(yù)Lewis肺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)調(diào)衡方含藥血清可促進(jìn)肺癌細(xì)胞中bcl-2基因下調(diào)，bax mRNA表達(dá)提升，提示調(diào)衡方含藥血清可能通過提升bax/bcl-2比值而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡。

通過調(diào)衡方含藥血清干預(yù)Lewis肺癌細(xì)胞，用RTPCR法測定肺癌細(xì)胞相關(guān)基因的變化表達(dá)，結(jié)果顯示，用藥后bcl-2可明顯下調(diào)，bax基因表達(dá)水平顯著上調(diào)。另外，通過調(diào)衡方含藥血清干預(yù)的Lewis肺癌細(xì)胞，其細(xì)胞周期時相分布改變(S期的比例隨著調(diào)衡方藥物劑量的增加而減少，G0/G1期比例而增加)，所以肺癌細(xì)胞增殖減慢。提示調(diào)衡方含藥血清對Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)部分機(jī)制可能與降低bcl-2表達(dá)及上調(diào)bax的表達(dá)有關(guān)，即通過升高bax/bcl-2比值，促進(jìn)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。

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