崔 彬，馮靜弦，胡 琪，饒力群

（湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

黃酮類化合物是植物代謝過程中產生的一類重要天然有機化合物，廣泛存在于自然界的植物中，屬植物次生代謝產物，近年來一直是國內外研究開發(fā)的熱點[1]。黃酮類化合物是以黃酮（2-苯基色原酮）為母核的一類衍生物[2]。它在植物界分布很廣，在植物體內大部分與糖結合成苷類或碳糖基的形式存在，也有的以游離形式存在。黃酮類化合物具有抗抑郁，抗氧化與消除自由基活性的作用，近年來被廣泛應用于醫(yī)藥領域[3]。

目前我國對羅漢果的廣泛使用主要在于提取甜苷，但其中黃酮類化合物含量也很高[4]。陳全斌等[5]利用反相高效液相色譜法，證實了羅漢果中含有黃酮苷元山奈酚，并首次發(fā)現(xiàn)含有黃酮苷元槲皮素，測得羅漢果鮮果中總黃酮含量5～10 mg/個，甜苷中總黃酮含量為1.42%。所以開發(fā)利用羅漢果黃酮有實際意義。

響應面分析法（Response Surface Methodology，RSM）是一種優(yōu)化工藝的有效方法，是利用合理的試驗設計采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，通過回歸方程尋求最優(yōu)工藝參數(shù)的一種實驗設計方法和數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法[6-7]。近年來，響應面分析法已越來越多地應用于工業(yè)生產中。本文以羅漢果黃酮的得率為響應值，在單因素試驗的基礎上，利用響應面法對羅漢果黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，得到最佳提取工藝，以提高羅漢果黃酮的提取效率，得到高純度的黃酮產品。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原 料 羅漢果果實購于長沙市高橋批發(fā)市場，剝殼，粉碎，備用。

1.1.2 試 劑 無水乙醇、超純水、氫氧化鈉（AR），天津市大茂化學試劑廠；亞硝酸鈉（AR），湖南匯虹試劑廠；硝酸鋁（AR），天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設備 RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；電熱恒溫風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；回流提取儀和ALZ04電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；FW177中草藥粉碎機，天津泰斯特；紫外-可見分光光度檢測器，Agilent1100。

1.2 試驗方法

1.2.1 羅漢果黃酮的提取 精確稱取5 g羅漢果粉末于圓底燒瓶中，加入一定量一定濃度的乙醇，在一定溫度下浸提一定時間，提取液抽濾，濃縮回收乙醇，得粗提液。

1.2.2 標準曲線的測定 精密吸取標準蘆丁溶液1、2、3、4、5 mL，分別置于 10 mL 刻度試管中，精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，最后用30%乙醇定容至10 mL，搖勻后放置15 min，置于比色皿中，在500 nm處測定吸光度，標準曲線的回歸方程為：y=1.284 x+0.143（R2=0.994 7）

1.2.3 測定方法 精密吸取提取液1 mL置于10 mL刻度試管中，按照1.2.2中的方法測定吸光度。用以下公式計算得率：e=Y×n×V/W×100%，其中Y為黃酮類物質質量濃度（mg/mL），V為原提取液體積（mL），W為羅漢果樣品質量（mg），n為稀釋倍數(shù)。

1.2.4 響應面法優(yōu)化提取條件 在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken方法，選取主要影響因素為自變量，得率（%）為響應值。通過響應曲面進行羅漢果黃酮提取工藝的優(yōu)化。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

按1.2.1方法，選擇乙醇濃度，提取時間，料液比，提取溫度為單因素，考察不同條件對提取效果的影響。結果如圖1～4。

圖1 乙醇濃度對得率的影響

圖2 提取時間對得率的影響

2.2 響應面法優(yōu)化羅漢果黃酮的提取工藝

根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，在單因素試驗結果基礎上，選取乙醇體積分數(shù)，提取溫度，提取時間3個因素的合適水平，對提取工藝進行三因素三水平響應面分析試驗，因素水平設置見表1。

圖3 料液比對得率的影響

圖4 提取溫度對得率的影響

表1 響應面中心組合試驗因素與水平

對羅漢果黃酮提取工藝進行響應面分析，具體試驗方案及結果見表2。

表2 響應面分析方案及試驗結果

2.2.1 方差分析和二次回歸方程擬合 利用Design Expert軟件對試驗結果進行二次多元回歸擬合，得到以羅漢果黃酮得率為響應值，與編碼自變量 X1，X2，X3的二次多項回歸方程：

模型的可靠性可從方差分析及相關系數(shù)來考察（表3）。結果表明，模型擬合度高，p<0.05，回歸模型的決定系數(shù)為0.956 5。失擬的Pr＞F值為0.056 2，是不顯著的，說明數(shù)據(jù)擬合效果較好，能夠很好地描述試驗結果。因此，可以用此模型對羅漢果黃酮得率進行分析和預測。由表3中的F值檢驗可以得到因子貢獻率為X1>X2>X3，即乙醇濃度>提取溫度>提取時間。

表3 響應面分析方案與試驗結果

2.2.2 交互作用分析 各因素X1、X2、X3對響應值得率所構成的三位空間的曲面圖，可反映各因素對其響應值的影響。響應面圖可較為直觀地看出各因素對得率的影響，曲線越陡峭，表明該因素對得率的影響越大，由等高線圖可以看出存在極值的條件應該在圓心處。圖5～7表明，在所選的各因素水平范圍內，對羅漢果黃酮得率的影響以乙醇濃度（X1）最大，提取溫度次之（X2），提取時間（X3）的影響最小。這也符合表3的方差分析結果。

圖5 乙醇濃度和提取溫度對羅漢果黃酮得率的響應面圖和等高線圖

圖6 乙醇濃度和提取時間對羅漢果黃酮得率的響應面圖和等高線圖

圖7 提取溫度和提取時間對羅漢果黃酮得率的響應面圖和等高線圖

2.2.3 驗證試驗 在軟件給出的處理方案中，本試驗選擇的最佳工藝條件為乙醇濃度76.59%，提取溫度84.29℃，提取時間0.76 h時，預測得率最優(yōu)值為1.573%。根據(jù)選擇的最佳工藝，調整羅漢果黃酮提取的工藝條件為乙醇濃度77%、提取溫度85℃、提取時間48 min，進行驗證試驗，3次平行試驗得到羅漢果黃酮提取液實際得率為1.538%。

3 結論

響應面分析方法是研究集中因素間交互作用的回歸分析方法，用該方法研究羅漢果黃酮提取工藝參數(shù)，求得的回歸方程精度高，可以準確找到整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應值的最優(yōu)值。該方法通過響應面圖直觀分析了各因素對羅漢果黃酮得率的影響，以及各因素之間對提取過程的交互影響。

通過Design-Expert7.0軟件采用Box-Behnken實驗設計對羅漢果黃酮提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，得到了最佳提取工藝，結合生產實際，可調整羅漢果黃酮提取的最佳工藝條件為乙醇濃度77%、提取溫度85℃、提取時間48 min，驗證試驗的實際得率為1.538%，與理論值接近，說明響應值的試驗值與回歸方程預測值吻合良好，優(yōu)化結果可信，具有實用價值。

[1]張鞍靈，高錦明，王姝清.黃酮類化合物的分布及開發(fā)利用[J].西北林學院學報，2000，15（1）：69-74.

[2]孫麗霞，成 蓓，王冬梅.果實類中藥材植物種植技術[M].北京：中國林業(yè)出版社，2001.113-124.

[3]王雪芬，陳再智，等.羅漢果的藥理及其應用研究[J].中藥材，2003，26（10）：771-772.

[4]斯建勇，陳迪華，常 琪，等.鮮羅漢果中黃酮苷的分離及結構測定[J].藥學學報，1994，29（2）：114-120.

[5]陳全斌，楊瑞云，義祥輝，等.RP-HPLC法測定羅漢果鮮果及甜苷中總黃酮含量[J].食品科學，2003，24（5）：133-135.

[6]張潤楚，鄭海濤，蘭 燕.試驗設計與分析及參數(shù)優(yōu)化[M].北京：中國統(tǒng)計出版社，2003.

[7]HILL W J,HUNTER W G.A review of response surface methodology：a literature review[J].Technometrics,1966,8:571-590.