馬志軍，薛家祿，南清衛(wèi)，陳朝武，劉向陽，李建勛，別松濤

（1.河南利偉生物藥業(yè)股份有限公司，河南 焦作454850；2.天津科技大學(xué) 工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

膽固醇，也稱膽甾醇，是一種天然的甾體資源，是合成維生素D3的主要原材料，廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[1］。美國CTFA（化妝品香料香精協(xié)會）化妝品原料手冊已將膽固醇列為可加入化妝品的天然活性物質(zhì)。

膽固醇在羊毛脂中含量很高，而我國羊毛脂資源豐富，因此，研究從羊毛脂中提取膽固醇意義重大。目前，從羊毛脂中提取膽固醇主要采用色譜法、溴化法、分子蒸餾法、超臨界萃取法、溶劑選擇結(jié)晶法和配合法等化學(xué)方法[2］，均用到了有機(jī)溶劑，不符合生態(tài)環(huán)保的科學(xué)理念[3］。

作者以羊毛脂為底物篩選菌株，利用篩選到的菌株對羊毛脂進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化制備膽固醇，并對發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 土壤樣品與培養(yǎng)基

土壤樣品采集自洗毛廢棄物傾倒處和膽固醇生產(chǎn)工廠。

PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯汁1000mL，葡萄糖20g，瓊脂20g，羊毛脂30g，121℃高壓滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖90g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，水1000mL，pH值7.6。

1.2 材料、試劑與儀器

羊毛脂，江陰星鵬化工有限公司。

三氯甲烷，東營富隆化工有限公司；硫酸，江蘇索普有限公司；標(biāo)準(zhǔn)膽固醇（色譜級），美國Sigma公司；乙腈、異丙醇、95%乙醇、無水乙醇、正己烷、乙醚、石油醚（30～600℃），市售。

N2000色譜工作站：杭州億捷科技有限公司。色譜條件：LC－10ATVP PLUS Wondersil C18色譜柱；流動相為乙腈－異丙醇（4∶1，體積比）；柱溫40℃；流速0.6mL·min－1；檢測波長210nm；進(jìn)樣量10μL。

1.3 方法

1.3.1 菌株的篩選與鑒定

取土壤樣品1.0g，置于已消毒的試管中，加入無菌水10mL后以渦旋振蕩器振蕩搖勻，靜置，取上層清液，滴于PDA平板培養(yǎng)基上，以玻璃棒涂勻，置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5d，待平板上長出菌落后，挑出單菌落于準(zhǔn)備好的PDA平板培養(yǎng)基上，根據(jù)形態(tài)特征判斷純的菌株，編號保存。

將分離得到的菌株分別接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，待長出單菌落后，取菌落下面的培養(yǎng)基1.0g置于試管中，加入三氯甲烷10mL并振蕩，使培養(yǎng)基中可能存在的膽固醇充分溶解，再加入10%濃硫酸10mL。觀察三氯甲烷層若呈血紅色，則推測此菌株具備轉(zhuǎn)化能力；若不呈血紅色，則不具備轉(zhuǎn)化能力[4］。將獲得的具有轉(zhuǎn)化能力的菌株編號N0012。

將菌株N0012在分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并用顯微鏡進(jìn)行鑒定。

1.3.2 羊毛脂微生物轉(zhuǎn)化制備膽固醇

以篩選獲得的菌株N0012進(jìn)行半固體平板培養(yǎng)較長時間，取菌落下的培養(yǎng)基0.5g于具塞試管中，加入5mL 95%乙醇，充分振蕩；然后加入10mL乙醚，振蕩；再加入10mL石油醚，充分振蕩后靜置使液層分離。取上層有機(jī)相1.0mL用氮?dú)獯蹈?，并?.5mL無水乙醇溶解進(jìn)行HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的鑒定

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，篩選獲得的菌株在分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落質(zhì)地致密、表面呈較緊密的絨狀、堅實(shí)、干燥、多皺，可初步判斷菌株為放線菌。在顯微鏡下觀察，細(xì)菌呈分枝絲狀，可進(jìn)一步確定菌株為放線菌[5］。

2.2 HPLC分析（圖1）

圖1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品（a）和羊毛脂轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（b）的HPLC圖譜Fig.1 The HPLC chromatograms of cholesterol standard（a）and the transformation product of wool grease（b）

由圖1可知，羊毛脂轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間基本相同，表明通過微生物轉(zhuǎn)化獲得了膽固醇。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵pH 值（圖2）

圖2 發(fā)酵pH值對膽固醇產(chǎn)量的影響Fig.2 The effect of fermentation pH value on cholesterol production

由圖2可知，發(fā)酵pH值為7.6時，膽固醇產(chǎn)量最高。故選擇適宜的發(fā)酵pH值為7.6。

2.3.2 發(fā)酵溫度（圖3）

由圖3可知，發(fā)酵溫度為30℃時，膽固醇產(chǎn)量最高。故選擇適宜的發(fā)酵溫度為30℃

。2.3.3 發(fā)酵時間（圖4）

由圖4可知，發(fā)酵110h時的膽固醇產(chǎn)量最高。故選擇適宜的發(fā)酵時間為110h。

2.3.4 碳源

碳源添加量為10g·L－1、固定其它條件，考察葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、糊精、乳糖、可溶性淀粉等不同碳源對膽固醇產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同碳源對膽固醇產(chǎn)量的影響Fig.5 The effect of different carbon sources oncholesterol production

由圖5可知，以麥芽糖為碳源時，膽固醇產(chǎn)量最高。故選擇最適碳源為麥芽糖。

麥芽糖濃度對膽固醇產(chǎn)量的影響見圖6。

圖6 麥芽糖濃度對膽固醇產(chǎn)量的影響Fig.6 The effect of maltose concentration on cholesterol production

由圖6可知，麥芽糖濃度為90g·L－1時，膽固醇產(chǎn)量最高。故選擇適宜的麥芽糖濃度為90g·L－1。

2.3.5 羊毛脂濃度（圖7）

圖7 羊毛脂濃度對膽固醇產(chǎn)量的影響Fig.7 The effect of wool grease concentration on cholesterol production

由圖7可知，羊毛脂濃度為80g·L－1時，膽固醇產(chǎn)量最高。故選擇適宜的羊毛脂濃度為80g·L－1。

3 結(jié)論

（1）從土壤中篩選到一株可將羊毛脂轉(zhuǎn)化為膽固醇的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)分析確定其為放線菌。

（2）以羊毛脂為底物微生物轉(zhuǎn)化制備膽固醇，其最佳發(fā)酵條件如下：發(fā)酵pH值7.6、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間110h、碳源麥芽糖濃度90g·L－1、羊毛脂濃度80g·L－1，在此條件下，膽固醇產(chǎn)量達(dá)到516mg·mL－1。

[1]Lower E S.Cholesterol in cosmetic formulation—A review [J］.Drug ＆ Cosmetic Industry，1975，116（5）：54－57.

[2]胡芬，譚蘭蘭，楊景昌，等.從羊毛醇中提取膽甾醇的工藝研究[J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2008，20（11）：1441－1446.

[3]Truter E V.The extraction of cholesterol from wool wax alcohol[J］.Manufacturing Chemist，1955，26（3）：231－235.

[4]國家藥典委員會.中國藥典[M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：57－58.

[5]阮繼生，黃英.放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類[M］.北京：科學(xué)出版社，2011：254－258.