夭建華，管 瑩，高 茜，米其利，朱洲海，李雪梅，繆明明

（云南煙草科學(xué)研究院，云南 昆明650106）

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)作為一類重要的體外試驗(yàn)，在新藥研發(fā)、化學(xué)物質(zhì)毒性評(píng)價(jià)方面發(fā)揮著重要的作用[1～5］。中性紅比色法和噻唑藍(lán)（MTT）比色法具有簡(jiǎn)便、快捷、靈敏等特點(diǎn)，是目前應(yīng)用較多的毒理學(xué)檢測(cè)細(xì)胞毒性的方法。作為評(píng)價(jià)方法，其結(jié)果的可重復(fù)性十分重要。

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞毒理學(xué)試驗(yàn)。但CHO細(xì)胞連續(xù)傳代至一定代次后，在檢測(cè)參比標(biāo)準(zhǔn)樣品的細(xì)胞毒性時(shí)，結(jié)果有顯著差異。為了尋找生物學(xué)狀態(tài)穩(wěn)定的連續(xù)傳代代次，作者在此比較了連續(xù)傳代培養(yǎng)的CHO細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，并研究了CHO細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果的影響，擬為提高中性紅比色法和MTT比色法進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的穩(wěn)定性提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

DMEM／F12（Solarbo 公 司），胎 牛 血 清 （美 國(guó)Klark），PBS，胰酶，中性紅（Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO）。

二氧化碳培養(yǎng)箱（Forma公司），96孔及24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning公司），酶標(biāo)儀（Bio－Rad公司），半自動(dòng)轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)（Borgwaldt RM20／CS）。

1.2 卷煙煙氣樣品的制備[6］

利用半自動(dòng)轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)抽吸40支標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試用卷煙3R4F，用直徑92mm的劍橋?yàn)V片捕集燃吸后產(chǎn)生的煙氣總粒相物（TPM），稱重；將劍橋?yàn)V片放入三角瓶中，加入適量DMSO，置于超聲儀上超聲20min；用無菌濾紙過濾，收集TPM提取液，調(diào)整TPM在DMSO中的終濃度為10mg·mL－1；將樣品分裝后儲(chǔ)存于－80℃，待用。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

將CHO細(xì)胞復(fù)蘇后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，記為第1代細(xì)胞。待細(xì)胞匯合率達(dá)到80%時(shí)，按1∶4比例傳代，匯合率再次達(dá)到80%時(shí)記為第3代細(xì)胞。以此類推，連續(xù)傳代至第17代。

1.3.2 細(xì)胞形態(tài)的觀察

細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，于倒置顯微鏡下觀察CHO細(xì)胞形態(tài)，并拍照記錄。

1.3.3 中性紅比色法測(cè)定受試物對(duì)細(xì)胞的毒性

分別取第1、5、9、13、17代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞，用胰酶進(jìn)行消化，吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以5×104個(gè)·mL－1的細(xì)胞密度接種于96孔板中，每孔200μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；加入終濃度分別為10μg·mL－1、75μg·mL－1、120μg·mL－1、160μg·mL－1、200μg·mL－1的受試物，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；加入濃度為100μg·mL－1的 中性紅DMEM無血清培養(yǎng)液，每孔200μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h；去除中性紅溶液，加入1%的甲醛溶液200μL，固定1min；去除固定液，每孔加入200μL中性紅萃取液（水∶乙醇∶乙酸 ＝49∶50∶1，現(xiàn)配），置于微量振蕩器上振蕩10min，用酶標(biāo)儀測(cè)量540nm處吸光度值。按下式計(jì)算細(xì)胞抑制率（X）：

式中：ODn、OD0、ODc分別為樣品、空白、細(xì)胞對(duì)照的多孔平均的吸光度值。

1.3.4 MTT比色法測(cè)定受試物對(duì)細(xì)胞的毒性

分別取第1、5、9、13、17代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞，用胰酶進(jìn)行消化，吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后分別以5×104個(gè)·mL－1的細(xì)胞密度接種于96孔板中，每孔200μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；加入終濃度分別為10μg·mL－1、75μg·mL－1、120μg·mL－1、160μg·mL－1、200μg·mL－1的受試物，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；加入濃度為5mg·mL－1的 MTT溶液，每孔20μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h；去除溶液，加入DMSO溶液，每孔200μL，置于微量振蕩器上振蕩10min，用酶標(biāo)儀測(cè)量490nm處吸光度值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞形態(tài)（圖1）

圖1 光鏡下CHO細(xì)胞的形態(tài)（×200）Fig.1 Morphology of CHO cells under light microscopy

由圖1可見，培養(yǎng)初期（第1代），細(xì)胞呈短梭狀，包漿折光性強(qiáng)，邊界清晰，排列整齊有序（圖1a）；培養(yǎng)中期（第5代、第9代），細(xì)胞開始呈長(zhǎng)梭狀，包漿折光性變?nèi)?，邊界分明，排列整齊（圖1b、c）；培養(yǎng)后期（第13代、第17代），胞體扁平且寬大，形態(tài)不規(guī)則，邊界模糊，排列凌亂無序，包漿內(nèi)累積大量細(xì)小顆粒（圖1d、e）。

2.2 細(xì)胞代次對(duì)受試物細(xì)胞抑制率的影響

分別采用中性紅比色法以及MTT比色法檢測(cè)3R4F參比卷煙煙氣受試劑量為10μg·mL－1、75μg·mL－1、120μg·mL－1、160μg·mL－1、200μg·mL－1時(shí)的CHO細(xì)胞抑制率，結(jié)果見圖2。

圖2 中性紅比色法（a）和MTT比色法（b）測(cè)定同一受試物對(duì)不同代次CHO細(xì)胞的抑制率Fig.2 Inhibition rate of the same inhibitor to CHO cells in different passages determined by neutral red assay（a）and MTT assay（b）

由圖2a可以看出，采用中性紅比色法測(cè)試CHO細(xì)胞抑制率，隨著細(xì)胞代次的升高，同一受試劑量下受試物對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率總體呈上升趨勢(shì)。其中第1代、第5代以及第9代3個(gè)試驗(yàn)組的細(xì)胞抑制率較為一致，而第13代和第17代2個(gè)試驗(yàn)組的測(cè)定結(jié)果與其余3個(gè)試驗(yàn)組有顯著差異（P＜0.05）。

由圖2b可以看出，采用MTT比色法測(cè)試CHO細(xì)胞抑制率，隨著細(xì)胞代次的升高，同一受試劑量下受試物對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率呈上升趨勢(shì)。其中第1代、第5代、第9代以及第13代4個(gè)試驗(yàn)組的細(xì)胞抑制率較為一致，而第17代測(cè)定結(jié)果與其余4個(gè)試驗(yàn)組有顯著差異（P＜0.05）。

2.3 討論

目前CHO細(xì)胞被國(guó)內(nèi)外多家煙草公司用于體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)卷煙煙氣的生物學(xué)毒性[7，8］。該細(xì)胞具有永生性，屬無限細(xì)胞系，理論上具有無限傳代的壽命。有研究報(bào)道，STO永生細(xì)胞系長(zhǎng)期的連續(xù)傳代會(huì)對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能特性造成影響[9］。那么同樣具有永生性的CHO細(xì)胞，長(zhǎng)期連續(xù)傳代培養(yǎng)是否同樣會(huì)對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響[10，11］，目前還未見報(bào)道。

本研究對(duì)連續(xù)傳代的CHO細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行了觀察。結(jié)果顯示，隨著細(xì)胞連續(xù)傳代代次的升高，CHO細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的退行性變化。從培養(yǎng)初期的呈短梭狀、包漿折光性強(qiáng)、邊界清晰、排列整齊有序的狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榕囵B(yǎng)后期的扁平且寬大、形態(tài)不規(guī)則、邊界模糊、包漿內(nèi)累積大量細(xì)小顆粒、排列凌亂無序的狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)超過9代后，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的衰老狀態(tài)。

為了進(jìn)一步檢測(cè)長(zhǎng)期連續(xù)傳代培養(yǎng)對(duì)CHO細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的差異是否會(huì)對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生影響，分別取不同代次的CHO對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，利用中性紅比色法以及MTT比色法對(duì)3R4F參比卷煙煙氣受試劑量為10μg·mL－1、75μg·mL－1、120μg·mL－1、160μg·mL－1、200μg·mL－1時(shí)的CHO細(xì)胞抑制率進(jìn)行檢測(cè)。無論是中性紅比色法還是MTT比色法測(cè)定的結(jié)果均顯示，隨著細(xì)胞代次的升高，同一受試劑量下受試物對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率均呈上升趨勢(shì)。

用連續(xù)培養(yǎng)9代以內(nèi)的CHO細(xì)胞進(jìn)行中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果較為一致，而連續(xù)培養(yǎng)13代以內(nèi)的CHO細(xì)胞進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果無顯著差異。從兩種方法檢測(cè)得到的細(xì)胞代次對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果的不同影響可以看出，中性紅比色法較MTT比色法對(duì)細(xì)胞的衰老更為靈敏。這可能是由于，中性紅作為一種陽離子活性染料，以離子擴(kuò)散方式進(jìn)入細(xì)胞膜并與溶酶體基質(zhì)的陰離子部分結(jié)合[3］。伴隨著細(xì)胞的衰老，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了改變（對(duì)細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察可以清楚看到，隨著細(xì)胞代次的升高，細(xì)胞邊界變得模糊，細(xì)胞膜大面積損傷），導(dǎo)致中性紅的攝入下降。而作為針對(duì)活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶的MTT比色法對(duì)細(xì)胞衰老的反應(yīng)相對(duì)滯后。

無論是用中性紅比色法還是MTT比色法對(duì)受試物的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)，隨著細(xì)胞連續(xù)傳代代次的升高，同一受試物在相同劑量下對(duì)細(xì)胞的抑制率均呈上升趨勢(shì)。這說明細(xì)胞代次的確是影響中性紅比色法和MTT比色法檢測(cè)穩(wěn)定性的重要因素。因此，為了提高細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性以及可比性，細(xì)胞的連續(xù)傳代培養(yǎng)代次是重要的控制因素。

3 結(jié)論

研究了CHO細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果的影響。對(duì)不同代次CHO細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，并利用中性紅比色法、MTT比色法檢測(cè)同種受試物對(duì)不同代次CHO細(xì)胞的抑制率是否有顯著差異。結(jié)果表明：隨著細(xì)胞代次的升高，細(xì)胞的形態(tài)、胞漿折光性、邊界、排列均發(fā)生了改變；同種受試物對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率隨細(xì)胞代次的升高呈上升趨勢(shì)；中性紅比色法較MTT比色法對(duì)細(xì)胞的衰老更靈敏。為了提高細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性以及可比性，細(xì)胞代次是需要控制的重要因素。

[1]林祥梅，王建峰，梅琳，等.用人角質(zhì)細(xì)胞評(píng)價(jià)4種化妝品的細(xì)胞毒性[J］.毒理學(xué)雜志，2008，22（1）：75－76.

[2]馬亞萍，白劍英.MTT法探討N－乙酰半胱氨酸對(duì)Na2SO3小鼠脾淋巴細(xì)胞毒性的影響[J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37（10）：1020－1021.

[3]熊習(xí)昆，楊穎，譚小華，等.3T3中性紅試驗(yàn)在化妝品光毒檢測(cè)中的應(yīng)用[J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2006，22（10）：1207－1209.

[4]劉銳克，周軍蘭，梁建輝.中性紅比色法檢測(cè)大鼠小腦神經(jīng)瘤活細(xì)胞[J］.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2003，17（1）：74－78.

[5]蘇建青，褚秀玲，李俊霞，等.中性紅染色法檢測(cè)人參皂苷及其衍生物對(duì)CEF增殖的影響[J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（35）：17523－17525.

[6]GB／T 19609－2004，卷煙用常規(guī)分析 用吸煙機(jī)測(cè)定總粒相物和焦油[S］.

[7]夭建華，繆明明，米其利，等.卷煙主流煙氣細(xì)胞毒性在5種細(xì)胞系中的反應(yīng)差異[J］.中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2011，17（3）：67－70.

[8]Johnson M D，Schilz J，Djordjevic M V，et al.Evaluation of in vitro assays for assessing the toxicity of cigarette smoke and smokeless tobacco[J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，18（12）：3263－3304.

[9]劇世強(qiáng)，盧曉，李冬，等.體外連續(xù)傳代培養(yǎng)對(duì)STO細(xì)胞生長(zhǎng)特性的影響[J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，34（Z1）：190－194.

[10]徐學(xué)振，于占革，楊威，等.不同代次兔髓核細(xì)胞凍存后的生物學(xué)特性比較[J］.中國(guó)脊柱脊髓雜志，2011，21（8）：680－684.

[11]蔡霞，高學(xué)軍，張鵬，等.體外培養(yǎng)不同代次人成纖維細(xì)胞的衰老程度[J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9（26）：60－62.