李秋涵，洪志丹

目前，惡性腫瘤的主要治療方法包括外科手術(shù)、放療、化療等。具有免疫調(diào)節(jié)功能的中藥在鞏固和加強抗腫瘤藥的治療效果、延長患者的生命和改善生存質(zhì)量方面顯現(xiàn)出了巨大的優(yōu)越性［1-2］。靈芝作為傳統(tǒng)中藥具有調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用，本文研究了富硒靈芝超微粉的抗腫瘤作用及其對機體免疫功能的影響。

1 實驗材料

1.1 動物 昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄兼有(每批試驗用一種性別)，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(軍)2007-004。

1.2 瘤株及細(xì)胞株 肉瘤S180瘤株、肝癌H22瘤株，沈陽市腫瘤研究所提供，昆明種小白鼠保種。

1.3 藥品與試劑 富硒靈芝超微粉，沈陽德寰靈芝種植基地提供。室溫干燥處保存，臨用前用蒸餾水溶解并稀釋至所需濃度。參一膠囊，吉林亞泰制藥有限公司生產(chǎn);環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司。

1.4 主要儀器 FA/JA1004系列上皿電子天平:上海精科天平儀器廠;PH050A型培養(yǎng)箱/干燥箱:上海一恒實驗儀器有限公司;XDS-1B型倒置生物顯微鏡:重慶光電儀器總公司。

2 實驗方法

2.1 對小鼠移植性肉瘤S180生長的影響 無菌操作，取傳代7d的荷S180小鼠腹水，細(xì)胞計數(shù)，用0.9%生理鹽水稀釋至濃度為2×107個/mL，每只小鼠右腋皮下接種0.2 mL。次日，按體質(zhì)量隨機分為5組，分別為富硒靈芝超微粉1.04、0.52、0.26 g/kg劑量組與陽性對照組(市售參一膠囊5.2 mg/kg)、模型(對照)組。各給藥組連續(xù)給藥15d，模型對照組灌胃給予蒸餾水。約藥體積為20 mL/kg。末次給藥后24 h，頸椎脫臼處死動物，分別稱體質(zhì)量、瘤重，計算抑瘤率，進行療效評價［3-4］。結(jié)果用Excel軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，該實驗重復(fù)3批。結(jié)果顯示，富硒靈芝超微粉劑量依賴性地抑制移植性肉瘤S180生長，且給藥組小鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增長。見表1。

2.2 富硒靈芝超微粉對小鼠移植性肝癌H22生長的影響 無菌操作，取傳代7d的荷肝癌H22小鼠腹水，細(xì)胞計數(shù)，用0.9%生理鹽水稀釋至濃度為2×107個/mL，每只小鼠右腋皮下接種0.2 mL(4×106個/只)。次日按體質(zhì)量隨機分為5組并給藥(給藥方法同“2.1”項)。給藥體積為20 mL/kg。末次給藥后24 h，頸椎脫臼處死動物，分別稱體質(zhì)量、瘤重，計算抑瘤率，進行療效評價［5］。結(jié)果用Excel軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，該實驗重復(fù)3批。結(jié)果顯示，富硒靈芝超微粉劑量依賴性地抑制移植性肝癌H22的生長，且給藥組小鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增 長。見表2。

表1 富硒靈芝超微粉對小鼠移植性肉瘤S180生長的影響(，n=3)

表1 富硒靈芝超微粉對小鼠移植性肉瘤S180生長的影響(，n=3)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。抑瘤率=(模型組瘤重-給藥組瘤重)/模型組瘤重×100%

批次 組別 劑量(g/kg) 動物數(shù)(只)體質(zhì)量(g)瘤重(g) 抑瘤率(%)開始 結(jié)束 開始 結(jié)束1 10 9 20.5±1.18 28.3±2.75 1.536±0.333參一膠囊組 5.2×10-3 10 10 20.3±1.36 28.8±2.89 1.023±0.265＊＊ 33.4富硒靈芝超微粉組 1.04 10 10 20.1±1.43 27.7±3.29 1.071±0.350＊＊ 30.3 0.52 10 10 19.6±0.79 26.1±1.91 1.123±0.313＊＊ 26.9 0.26 10 9 20.5±1.33 27.9±2.21 1.209±0.221* 21.3 2模型組 10 10 19.6±1.30 27.5±2.32 1.602±0.467參一膠囊組 5.2×10-3 10 10 19.5±0.88 27.0±1.84 1.040±0.572＊＊ 35.1富硒靈芝超微粉組 1.04 10 10 19.6±0.81 26.6±1.34 1.162±0.369＊＊ 27.5 0.52 10 10 19.0±0.83 26.5±1.33 1.305±0.488* 18.5 0.26 10 10 19.5±1.12 27.6±1.81 1.427±0.465 10.9 3模型組 10 10 19.8±0.69 26.9±2.69 1.745±0.659參一膠囊組 5.2×10-3 10 10 19.8±0.95 26.8±1.48 1.057±0.441＊＊ 39.4富硒靈芝超微粉組 1.04 10 10 19.2±0.81 27.4±1.28 1.203±0.421＊＊ 31.1 0.52 10 10 19.3±0.58 27.3±2.80 1.257±0.486* 27.9 0.26 10 10 19.5±0.89 26.4±1.17 1.457±0.438 16模型組.5

表2 富硒靈芝超微粉對小鼠移植性H22肝癌生長的影響(±s，n=3)

表2 富硒靈芝超微粉對小鼠移植性H22肝癌生長的影響(±s，n=3)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

批次 組別 劑量(g/kg) 動物數(shù)(只)體質(zhì)量(g)瘤重(g) 抑瘤率(%)開始 結(jié)束 開始 結(jié)束1 10 9 19.7±0.73 25.7±2.73 1.678±0.724參一膠囊組 5.2×10-3 10 10 19.5±0.82 26.2±1.90 1.027±0.290＊＊ 38.8富硒靈芝超微粉組 1.04 10 10 19.3±0.65 26.9±1.52 1.106±0.413＊＊ 34.1 0.52 10 10 19.2±0.62 26.7±1.67 1.235±0.311* 26.4 0.26 10 10 19.7±0.79 25.5±1.83 1.476±0.459 12.0 2模型組 10 9 19.6±1.05 26.8±2.06 2.131±0.858參一膠囊組 5.2×10-3 10 10 19.4±1.11 26.2±2.07 1.264±0.695＊＊ 40.7富硒靈芝超微粉組 1.04 10 9 19.8±0.85 26.8±1.18 1.413±0.622＊＊ 33.7 0.52 10 10 19.7±0.91 26.2±1.58 1.652±0.563* 22.5 0.26 10 10 19.5±1.04 26.7±1.70 1.858±0.723 12.8 3模型組 10 10 20.1±1.36 27.6±2.94 2.089±0.647參一膠囊組 5.2×10-3 10 10 20.8±1.24 28.5±2.98 1.360±0.558＊＊ 34.9富硒靈芝超微粉組 1.04 10 10 20.2±1.32 26.5±3.24 1.441±0.537* 31.0 0.52 10 10 19.8±1.05 26.7±1.29 1.507±0.326* 27.8 0.26 10 10 20.2±1.37 27.9±2.85 1.750±0.654 16模型組.2

2.3 富硒靈芝超微粉對荷肉瘤S180小鼠脾臟及胸腺指數(shù)的影響 無菌操作，肉瘤S180的接種及分組同“2.1”，另設(shè)不接瘤的空白對照組。實驗結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，取其脾臟及胸腺，稱重，計算脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。脾臟(胸腺)指數(shù)=脾臟(胸腺)重量/體質(zhì)量 × 10［6］。各組結(jié)果用 Excel軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果顯示，模型組小鼠脾臟及胸腺指數(shù)較空白對照組顯著降低;與模型對照組比較，富硒靈芝超微粉1.0、0.52 g/kg能夠顯著增強荷肉瘤S180小鼠的脾臟指數(shù)，富硒靈芝超微粉1.04 g/kg能夠顯著增強荷肉瘤S180小鼠的胸腺指數(shù)。見表3。

表3 富硒靈芝超微粉對荷肉瘤S180小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響()

表3 富硒靈芝超微粉對荷肉瘤S180小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響()

注:與模型組比較，*P＜0.05;與空白對照組比較，#P＜0.05

組別 劑量(g/kg)動物數(shù)(只)脾臟指數(shù)(mg/10g)胸腺指數(shù)(mg/10g)10 129.6±24.04 37.3±9.28模型組 10 101.4±29.84# 29.5±4.94#富硒靈芝超微粉 1.04 10 134.4±24.29* 39.1±8.34*0.52 10 131.4±28.76* 35.1±6.93 0.26 10 104.8±21.81 33.5±6.72參一膠囊 5.2×10-310 132.8±24.30* 38.8±8.86空白對照組*

2.4 富硒靈芝超微粉對荷肝癌H22小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 無菌操作，肝癌H22的接種及分組同“2.2”，另設(shè)不接瘤的空白對照組。于實驗前3d，每只鼠腹腔注射0.2 mL 4%的淀粉生理鹽水溶液，誘發(fā)腹腔的無菌性炎癥。于實驗日，頸椎脫臼處死小鼠，75%乙醇全身浸泡消毒，向小鼠腹腔內(nèi)注入5 mL預(yù)冷的PBS，腹部按摩，抽取腹腔細(xì)胞懸液約4 mL。將懸液轉(zhuǎn)入離心管中，1 500 r/min、4℃離心5 min，棄去上清，再用 PBS清洗1次。將細(xì)胞轉(zhuǎn)入盛有含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL。以100 μL/孔加入 96 孔板中，置 5%CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，甩棄上清，用PBS清洗96孔板3次，將孔內(nèi)液體甩干。每孔加入0.075%的中性紅溶液100 μL，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 1 h，取出培養(yǎng)板，甩棄中性紅。用PBS清洗96孔板4次，加入乙醇∶冰醋酸(1∶1)100 μL，靜置過夜，用酶標(biāo)儀測540 nm處的OD值［7-8］。各組結(jié)果用Excel軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果顯示，模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外吞噬中性紅的能力較空白對照組顯著降低;與模型組比較，富硒靈芝超微粉1.04、0.52 g/kg能夠顯著增強荷肝癌H22小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外吞噬中性紅的能力。見表4。

表4 富硒靈芝超微粉對荷肝癌H22小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響()

表4 富硒靈芝超微粉對荷肝癌H22小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響()

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與空白對照組比較，##P＜0.01

組別 劑量(g/kg) 動物數(shù)(只)OD值(540 nm)10 0.552±0.085模型組 10 0.285±0.071##富硒靈芝超微粉 1.04 10 0.484±0.053＊＊0.52 10 0.352±0.068*0.26 10 0.203±0.027參一膠囊 5.2×10-3 10 0.435±0.054空白對照組＊＊

2.5 富硒靈芝超微粉對免疫功能低下小鼠血清溶血素水平的影響 選取健康昆明種小鼠60只，隨機分為6組，分別為富硒靈芝超微粉1.04、0.52、0.26 g/kg劑量組及參一膠囊5.2 mg/kg組、模型組(給予環(huán)磷酰胺)及空白對照組。各組連續(xù)給藥，于給藥第5天，給每只鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液0.2 mL。除空白對照組外，其余各組分別于第4天、第9天，按75 mg/kg劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺，造成免疫功能低下模型。連續(xù)給藥10d，第11天進行實驗。各組小鼠眼底靜脈叢取血，離心分離血清，用生理鹽水將血清稀釋50倍，取稀釋血清1 mL加入反應(yīng)管中，再加入0.5%雞紅細(xì)胞懸液0.5 mL，然后在冰水中加入0.5 mL補體(10%3只豚鼠混合血清)，將反應(yīng)管中溶液搖勻，置于37℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min，反應(yīng)過程中振搖2次，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)管置于0℃冰箱中終止反應(yīng)。離心，取上清液于722型分光光度計540 nm處比色，測定吸光度(以不加小鼠血清的空白對照管調(diào)0)，以上清液的吸光度代表小鼠血清溶血素水平的高低［9］。各組結(jié)果用Excel軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果顯示，模型組小鼠血清溶血素水平較空白對照組顯著降低;與模型組比較，富硒靈芝超微粉1.04、0.52 g/kg能夠顯著提高小鼠的血清溶血素水平，改善環(huán)磷酰胺對小鼠血清溶血素水平產(chǎn)生的抑制作用。見表5。

表5 富硒靈芝超微粉對免疫功能低下小鼠血清溶血素水平的影響()

表5 富硒靈芝超微粉對免疫功能低下小鼠血清溶血素水平的影響()

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與空白對照組比較，##P＜0.01

組別 劑量(g/kg) 只 OD值(540 nm)空白對照組 —10 0.445±0.040模型組 CTX 75 mg/kg×2次 10 0.128±0.049##富硒靈芝超微粉+CTX 1.04 10 0.350±0.083＊＊0.52 10 0.259±0.091*0.26 10 0.100±0.030參一膠囊+CTX 5.2×10-3 10 0.354±0.078＊＊

3 討論

本文采用的移植性腫瘤模型，是考察藥物抗腫瘤作用的典型體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ?。模型的?yōu)點在于能夠保持機體的完整性，并使機體與外界環(huán)境保持正常的聯(lián)系，因此，能更加客觀地反映藥物的抗腫瘤活性［11］。本研究表明，富硒靈芝超微粉能夠顯著降低荷肉瘤S180、肝癌H22小鼠的平均瘤重，確定了其具有抗腫瘤活性。通過觀察免疫系統(tǒng)多個指標(biāo)的變化，考察了富硒靈芝超微粉對機體免疫功能的影響，結(jié)果表明，富硒靈芝超微粉通過影響免疫系統(tǒng)的不同環(huán)節(jié)而增強機體免疫功能，從而產(chǎn)生抗腫瘤活性。

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