張春輝，孫慶申，2，吳 桐，2，李 冰，韓德權(quán)，2

（1．黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；2．農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500）

當(dāng)今，復(fù)合發(fā)酵劑應(yīng)用十分廣泛。大多集中于酸奶發(fā)酵、香腸發(fā)酵和飼料發(fā)酵［1－3］等領(lǐng)域，所有關(guān)于復(fù)合面食發(fā)酵劑的研究報(bào)道幾乎全部都是由各菌種單獨(dú)培養(yǎng)后混合而成［4－6］，而并不是混合培養(yǎng)［7］。加之，實(shí)驗(yàn)室研究使用昂貴藥品配制培養(yǎng)基，不切合復(fù)合饅頭發(fā)酵劑工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際。本試驗(yàn)以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)多菌復(fù)合饅頭發(fā)酵劑混合培養(yǎng)工業(yè)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最佳的工業(yè)培養(yǎng)基配方。

1 材料與方法

1．1 材 料

1．1．1 菌 種

面包酵母 （Saccharomyces cerevisiae）和副干酪乳桿菌 （Lactobacillus paracasei）：本實(shí)驗(yàn)室分離；嗜酸乳桿菌 （Lactobacillus acidophilus）：黑龍江大學(xué)食品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；異常漢遜酵母（Hanseula anomala）：菌種編號(hào)2．592，購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1．1．2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：按照文獻(xiàn) ［8］的方法配制，121℃滅菌20min備用。

YEPD－溴甲酚綠固體培養(yǎng)基：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%，溴甲酚綠0．01 mg／L。112℃滅菌20min。

1．2 方 法

1．2．1 培養(yǎng)方法

混合培養(yǎng)工藝［9］。

1．2．2 測(cè)定方法

總生物量測(cè)定：混合培養(yǎng)后，利用分光光度計(jì)在550nm處測(cè)定吸光值，間接反映總生物量。

培養(yǎng)基殘?zhí)菧y(cè)定：蒽酮比色法［10］。

面包酵母計(jì)數(shù)：稀釋平板計(jì)數(shù)法，無菌水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，取0．1mL涂YEPD－溴甲酚綠平板，37℃培養(yǎng)，計(jì)數(shù)面包酵母菌落。

1．2．3 優(yōu)化方法

以玉米粉糖化液為碳源、豆粕粉水解液為有機(jī)氮源、硫酸銨為無機(jī)氮源、玉米漿作生長(zhǎng)因子，采用單因素法和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［11－12］優(yōu)化多菌復(fù)合饅頭發(fā)酵劑混合培養(yǎng)工業(yè)培養(yǎng)基。

1．2．3．1 碳源最適濃度范圍選擇試驗(yàn)

以1%豆粕水解液和0．3%硫酸銨作混合氮源，添加 0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%的玉米粉糖化液作碳源，0．5%玉米漿配制培養(yǎng)基，調(diào)初始pH＝6．0，滅菌。根據(jù)文獻(xiàn) ［9］培養(yǎng)工藝操作，對(duì)面包酵母菌落計(jì)數(shù)，確定玉米粉糖化液最適濃度范圍。

1．2．3．2 氮源最適濃度范圍選擇試驗(yàn)

1）豆粕水解液作有機(jī)氮源。用已確定的玉米粉糖化液添加量，以豆粕水解液作有機(jī)氮源，添加量為0%、2%、4%、6%、8%、10%，硫酸銨0．3%，玉米漿0．5%配制培養(yǎng)基，調(diào)初始pH＝6．0。根據(jù)文獻(xiàn) ［9］培養(yǎng)工藝操作，對(duì)面包酵母菌落計(jì)數(shù)，確定豆粕水解液最適濃度范圍。

2）硫酸銨作為無機(jī)氮源。用已確定的玉米粉糖化液添加量，以0%、0．25%、0．5%、0．75%、1%、1．25%硫酸銨作無機(jī)氮源，玉米漿0．5%，豆粕水解液按試驗(yàn)確定濃度添加，配制培養(yǎng)基，調(diào)初始pH＝6．0。根據(jù)文獻(xiàn) ［9］培養(yǎng)工藝操作。對(duì)面包酵母菌落計(jì)數(shù)，以確定硫酸銨最適濃度范圍。

1．2．3．3 玉米漿最適濃度范圍選擇試驗(yàn)

用試驗(yàn)已確定的碳氮源濃度，用0%、0．5%、1%、1．5%、2%的玉米漿作生長(zhǎng)因子，調(diào)初始pH＝6．0。根據(jù)文獻(xiàn) ［9］培養(yǎng)工藝操作，對(duì)面包酵母菌落計(jì)數(shù)以確定玉米漿濃度范圍。

1．2．3．4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化工業(yè)培養(yǎng)基

根據(jù)前期單因素試驗(yàn)，優(yōu)選各因素3個(gè)水平采用4因素3水平 ［L9（34）］正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表1 正交設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design／%

2 結(jié)果與分析

2．1 單因素法確定各因素最適濃度范圍

2．1．1 碳源最適濃度范圍選擇

圖1中，當(dāng)濃度為12%和14%時(shí)的面包酵母生物量分別為 （6．8±0．136 5）×108cfu／mL和 （6．8±0．215 0）×108cfu／mL，p＝0．767 （p＞0．05），說明玉米粉糖化液濃度12%和14%對(duì)面包酵母生物量影響不顯著，故選擇玉米粉糖化液濃度為12%。

2．1．2 氮源最適濃度范圍選擇

2．1．2．1 豆粕水解液作有機(jī)氮源

圖1 玉米粉糖化液濃度對(duì)面包酵母生物量影響Fig．1 Effect of the corn saccharification solution concentrations on the biomass of saccharomyces cerevisiae

圖2中，隨著豆粕水解液濃度的增加，面包酵母的生物量變化不明顯。當(dāng)濃度為0%和2%時(shí)的面包酵母生物量分別為 （3．4±0．18）×108cfu／mL和 （4．0±0．096）×108cfu／mL，p＝0．023（p＜0．05），說明豆粕水解液濃度0%和2%對(duì)面包酵母生物量影響顯著。因此，選擇豆粕水解液濃度2%進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖2 豆粕水解液濃度對(duì)面包酵母生物量的影響Fig．2 Effect of the soybean meal hydrolyzate concentrations on the biomass of saccharomyces cerevisiae

2．1．2．2 硫酸銨作無機(jī)氮源

硫酸銨添加量與面包酵母生物量關(guān)系見圖3，隨著硫酸銨添加量的增加，面包酵母生物量隨之增加，添加量為1．0%和1．25%時(shí)的面包酵母生物量分別 為 （5．8±0．13）×108cfu／mL 和 （5．8±0．19）×108cfu／mL ，p＝0．981 （p＞0．05），說明硫酸銨1．0%和1．25%的添加量對(duì)面包酵母生物量影響不顯著，故選擇硫酸銨添加量為1．0%。

2．1．3 玉米漿最適濃度范圍選擇

由圖4可見，隨著玉米漿濃度的增加，面包酵母生物量隨之增加，當(dāng)濃度為1%和1．5%時(shí)的面包酵母生物量分別為 （3．9±0．105 4）×108cfu／mL和 （4．0±0．113 7）×108cfu／mL，p＝0．518（p＞0．05），說明玉米漿濃度在1%和1．5%時(shí)對(duì)面包酵母生物量影響不顯著，故選擇玉米漿濃度1%。

2．2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化工業(yè)培養(yǎng)基

通過單因素試驗(yàn)確定各因素的濃度，在此基礎(chǔ)上選擇合適的水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可見，各因素對(duì)混菌吸光值即總生物量的影響次序?yàn)椋河衩追郏径蛊桑居衩诐{＞硫酸銨，其最優(yōu)組合為A3B3C2D1，即玉米粉糖化液13%，豆粕水解液3%，硫酸銨1%，玉米漿0．8%。以面包酵母生物量作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，各因素對(duì)面包酵母生物量的影響次序?yàn)椋河衩追郏居衩诐{＞硫酸銨＞豆粕，其最優(yōu)組合為A3B3C2D1，即玉米粉糖化液13%，豆粕水解液3%，硫酸銨1%，玉米漿0．8%。另外明顯地，玉米粉糖化液和玉米漿對(duì)面包酵母生物量具有顯著影響。以殘?zhí)亲鳛樵u(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，各因素對(duì)殘?zhí)堑挠绊懘涡驗(yàn)椋河衩追郏径蛊桑玖蛩徜@＞玉米漿，其最優(yōu)組合為A3B3C1D1，即玉米粉糖化液13%，豆粕水解液3%，硫酸銨0．9%，玉米漿0．8%。玉米粉糖化液對(duì)殘?zhí)蔷哂酗@著影響。綜上所述，確定多菌復(fù)合饅頭發(fā)酵劑混合培養(yǎng)工業(yè)培養(yǎng)基配方為A3B3C2D1，即玉米粉糖化液13%，豆粕水解液3%，硫酸銨1%，玉米漿0．8%。此配方與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)第9組試驗(yàn)相同。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，面包酵母生物量為5．8×108cfu／mL，漢遜酵母生物量為0．9×108cfu／mL，乳酸菌總生物量為3．4×108cfu／mL。

表2 多菌復(fù)合饅頭發(fā)酵劑工業(yè)培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of optimization of industrial medium for multi－microbes complex steamed bread fermentation agent

3 討 論

混合培養(yǎng)一般是為了獲取更多的發(fā)酵產(chǎn)物，已有的報(bào)道大都以獲取某些純培養(yǎng)無法得到的產(chǎn)物和利用菌株之間協(xié)同作用，提高產(chǎn)率為目的［13－15］。以獲取菌體為目的的混合培養(yǎng)中試特別是不同菌屬之間的研究在國(guó)內(nèi)外尚未見到報(bào)道。本試驗(yàn)中優(yōu)化后的培養(yǎng)基，面包酵母菌生物量和混菌總生物量都是過去本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基的幾倍，與國(guó)內(nèi)一些研究相比各有優(yōu)劣。李翔國(guó)［16］用玉米面、葡萄糖、酵母粉和馬鈴薯淀粉做培養(yǎng)基對(duì)乳酸菌復(fù)合系培養(yǎng)生物量為5．0×107cfu／mL；楊麗麗［17］優(yōu)化了乳酸乳球菌乳脂亞種、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌的增殖培養(yǎng)基，混菌生物量為2．1×109cfu／mL；劉丹［18］優(yōu)化了嗜酸乳桿菌的增菌培養(yǎng)基，優(yōu)化后生物量是8．6×109cfu／mL；A．Laitila［19］采用麥芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)植物乳桿菌，生物量是4．0×109cfu／mL。究其生物量產(chǎn)生差距的原因有：①所選用培養(yǎng)基原料上的差別所致，文獻(xiàn)中研究使用實(shí)驗(yàn)室分析純藥品，本試驗(yàn)中采用的是更加接近生產(chǎn)的玉米粉、豆粕等工業(yè)原料，營(yíng)養(yǎng)素的濃度和純度上存在差距；②試驗(yàn)培養(yǎng)方法為順序接種，異常漢遜酵母、副干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌是在培養(yǎng)進(jìn)行9h之后同時(shí)接種，再培養(yǎng)11h后結(jié)束，這時(shí)兩株乳酸菌都還未進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，因此本試驗(yàn)混菌生物量與某些研究中的生物量會(huì)有一定差距。

4 結(jié) 論

多菌復(fù)合饅頭發(fā)酵劑混合培養(yǎng)工業(yè)培養(yǎng)基配方為：玉米粉糖化液13%、豆粕水解液3%、硫酸銨1．0%、玉米漿0．8%、KH2PO40．3%、MgSO4·7H2O 0．06%、MnSO40．02%，pH＝6．0。在優(yōu)化的培養(yǎng)基上進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，面包酵母生物量提高到5．8×108cfu／mL，與正交試驗(yàn)結(jié)果接近，是MRS培養(yǎng)基獲得面包酵母生物量 （1．4×108cfu／mL）的4倍以上；混菌總生物量可達(dá)到1．0×109cfu／mL。

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