陳 忻，陳曉剛，陳杰文，孫恢禮

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院理學(xué)院，廣東 佛山 528000；2.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，廣東 廣州 510301；3.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049)

波紋巴非蛤酶解過(guò)程的肽譜變化

陳 忻1,2,3，陳曉剛1，陳杰文1，孫恢禮2,3

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院理學(xué)院，廣東 佛山 528000；2.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，廣東 廣州 510301；3.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049)

以波紋巴非蛤?yàn)樵希附?～6h制備酶解液。在SDS-PAGE電泳法測(cè)定肽譜的基礎(chǔ)上，再利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定波紋巴非蛤酶解的肽譜變化。結(jié)果表明：酶解前3h時(shí)酶解液的肽分子的分子質(zhì)量大概主要集中在100、50、2kD，酶解液大都是大分子肽或者中分子肽；酶解4、5、6h時(shí)酶解液的肽分子的分子質(zhì)量基本沒(méi)變化，其分子質(zhì)量主要集中在400～600D，即為小分子肽，酶解4h時(shí)為酶解終點(diǎn)。

波紋巴非蛤；活性肽；SDS-PAGE電泳法；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

21世紀(jì)是海洋經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的世紀(jì)，海洋天然活性物質(zhì)是現(xiàn)代生物學(xué)研究熱點(diǎn)，而天然海洋活性肽是海洋活性物質(zhì)研究的重要組成部分。海洋生物體內(nèi)的各種活性物質(zhì)，是開(kāi)發(fā)研究海洋生化藥物與功能性保健食品的原料寶庫(kù)[1]，海洋豐富的生物資源為肽的制備提供了充足的物種資源與蛋白質(zhì)資源。其中，運(yùn)用酶工程技術(shù)，是開(kāi)發(fā)利用海洋生物蛋白資源的重要途徑。海洋貝類(lèi)蛋白酶解物含有大量的短肽、多肽、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)功能成分，并產(chǎn)生了一些具有特殊生理功能的生物活性肽，具有調(diào)節(jié)腸胃運(yùn)動(dòng)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗菌、抗血栓、抗病毒、抗癌、抗氧化、清除自由基、促進(jìn)礦物質(zhì)元素吸收等一方面或者多方面的重要生理功效，可以被開(kāi)發(fā)為飼料蛋白源、海鮮調(diào)味料、保健食品、營(yíng)養(yǎng)食品、天然藥物、功能化妝品等，具有廣泛的應(yīng)用前景[2-5]。

目前，人們已經(jīng)對(duì)寡肽在動(dòng)物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，表明動(dòng)物體內(nèi)可能存在多種寡肽的轉(zhuǎn)運(yùn)體系。研究認(rèn)為，在蛋白質(zhì)的多肽鏈內(nèi)部普遍存在著功能區(qū)，這些功能區(qū)是生物活性肽的可能前體。選擇合適的蛋白酶水解這些多肽鏈，把具有生物活性的肽片段釋放出來(lái)，可制備出具有各種生理功能的生物活性肽[6]。在營(yíng)養(yǎng)學(xué)上肽類(lèi)物質(zhì)的理化特性和營(yíng)養(yǎng)功能比蛋白質(zhì)和氨基酸有更多的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用到各類(lèi)功能性食品、化妝品、保健品、醫(yī)療藥品等中，能增加其附加值和活性[7-10]。然而膠原多肽的許多的功能特性僅有其中一小部分已被實(shí)際應(yīng)用，有待深入研究和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。因此，酶解制備小分子肽的研究有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。

波紋巴非蛤(Paphia undulata)，又名花甲螺，主要分布在廣東、廣西及海南沿海。目前，波紋巴非蛤養(yǎng)殖“工業(yè)化”，產(chǎn)量逐年遞增，但是國(guó)內(nèi)對(duì)波紋巴非蛤的利用仍主要以直接食用為主。隨著對(duì)波紋巴非蛤的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的全面研究，以波紋巴非蛤?yàn)樵希a(chǎn)貝類(lèi)提取物，研制以貝類(lèi)為原料的保健食品、藥品、化妝品已成為發(fā)展趨勢(shì)[11-13]。本實(shí)驗(yàn)研究酶解波紋巴非蛤過(guò)程中肽譜的變化，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮波紋巴非蛤，購(gòu)于佛山山紫市場(chǎng)，由中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所孫恢禮研究員鑒定。

木瓜蛋白酶(2×106U/g，食品級(jí)) 廣州威佳科技有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris 美國(guó)Bio Basic 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent6120型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司；BP252AG攪拌機(jī) 廣東美的生活電器制備有限公司；SHZ-82A恒溫振蕩器 江蘇金壇市富華儀器有限公司；FA2004N電子分析天平 上海精密儀器有限公司；PHS-3C型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；800型離心沉淀器上海手術(shù)器械廠；電爐(800W) 高勝五金電器廠；DYY-8C電泳儀、DYY-24A電泳槽 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 酶解液制備的流程

新鮮波紋巴非蛤去殼取肉→取60g肉洗凈攪拌勻漿(料水比1∶3(m/V))→加入占蛤肉質(zhì)量1%的木瓜蛋白酶，充分?jǐn)嚢?，再平均分?份于pH值6.3條件下分別恒溫酶解1、2、3、4、5、6h→水浴加熱滅酶→離心分離提取上層清液，制得酶解液4℃保存?zhèn)溆?/p>

根據(jù)前期工作已發(fā)表文獻(xiàn)[11]，以木瓜蛋白酶制備得到的海洋生物活性肽水解度及平均肽鏈長(zhǎng)度最優(yōu)。

1.3.2 酶解液中分子肽分子質(zhì)量的測(cè)定[14]

采用SDS-PAGE電泳法對(duì)酶解液中的小分子肽進(jìn)行分析。

1.3.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定酶解液肽譜的變化[15-16]

Agilent6120型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；柱子Agilent：TC-C18液相色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇、水體積比為20∶80；流速：0.5mL/min；相檢測(cè)器 DAD 波長(zhǎng)：215nm；時(shí)間：60min。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE電泳法對(duì)分子肽的分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

圖1 樣品的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of Paphia undulate muscle hydrolysates

由圖1可知，酶解1h時(shí)，酶解液中主要是大分子肽，其主要分子質(zhì)量在50～75kD，但在電泳帶25、35kD處也出現(xiàn)了小部分的分子肽；酶解2h時(shí)，50～75kD的大分子肽開(kāi)始減少，25～35kD 范圍內(nèi)的分子肽明顯增加，并在1.5kD開(kāi)始有分子肽出現(xiàn)；酶解3h時(shí)，分子質(zhì)量為1.5kD以下的分子肽明顯增多，其他分子質(zhì)量的分子肽則相應(yīng)減少；酶解4h時(shí)，分子質(zhì)量為1.5kD以下的分子肽繼續(xù)增多，此時(shí)酶解差不多達(dá)到終點(diǎn)；酶解5、6h時(shí)，各分子質(zhì)量的分子肽的分布情況跟酶解4h時(shí)相似。經(jīng)分析可知，酶解的前4h，酶解液中的分子肽分子質(zhì)量有明顯的變化，大分子肽不斷酶解成更小的分子肽，酶解4h后的肽譜沒(méi)有明顯的變化。

2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定酶解液肽譜的結(jié)果

2.2.1 酶解1h時(shí)酶解液高效液相色譜圖結(jié)果

圖2 酶解1h時(shí)酶解液高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 1 h Paphia undulate muscle hydrolysate

圖3 酶解1h時(shí)酶解液的陽(yáng)離子質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of 1 h Paphia undulate muscle hydrolysate

由圖2可知，酶解液入柱后，在酶解1h的第6、9、21、37分鐘附近處出現(xiàn)峰值。其中在第6分鐘附近，質(zhì)荷比為98×103的碎片離子豐度最高，表示這個(gè)碎片離子很穩(wěn)定(圖3A)；在第9分鐘附近，質(zhì)荷比為103.2×103的碎片離子豐度最高，另一較高豐度的負(fù)荷比是86.2×103(圖3B)；在第21分鐘附近，質(zhì)荷比為99.4×103的碎片離子豐度最高(圖3C)；在37min附近，負(fù)荷比為87.5×103和107.5×103的碎片離子豐度都較高(圖 3D)。

2.2.2 酶解2h時(shí)酶解液高效液相色譜圖結(jié)果

圖4 酶解2h時(shí)酶解液高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of 2 h Paphia undulate muscle hydrolysate

由圖4可知，酶解液入柱后，在酶解2h的第11、20、27、45分鐘附近處出現(xiàn)峰值。由圖5可知，在第11分鐘附近，質(zhì)荷比為52.3×103的碎片離子豐度最高，表示這個(gè)碎片離子很穩(wěn)定，其他的碎片離子的質(zhì)荷比分別為37.2×103、73.8×103也較高，與酶解液1h比較，酶解2h時(shí)酶解液的大分子肽100×103附近的豐度降低了，質(zhì)荷比為23.4×103的碎片離子豐度增大；在第20、37、45分鐘附近，碎片離子豐度最高的質(zhì)荷比分別為為37.4×103、64.8×103、42.5×103的，碎片離子的質(zhì)荷比在100×103附近也同樣明顯降低了，質(zhì)荷比在20×103附近的的分度也都增大。

2.2.3 酶解3h時(shí)酶解液高效液相色譜圖結(jié)果

圖6 酶解3h時(shí)酶解液高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of 3 h Paphia undulate muscle hydrolysate

圖7 酶解3h時(shí)酶解液中陽(yáng)離子質(zhì)譜圖Fig.7 Mass spectra of 3 h Paphia undulate muscle hydrolysate

由圖6可知，酶解液入柱后，在酶解3h的第6、8、21、36分鐘附近處出現(xiàn)峰值。由圖7可知，這4個(gè)峰值當(dāng)碎片離子豐度最高時(shí)的質(zhì)荷比分別為2.31×103、1.78×103、1.68×103和2.1×103，且在這幾個(gè)質(zhì)荷比值的附近也存在其他豐度較高的數(shù)值，與酶解1、2h酶解液譜圖相比較，此時(shí)的質(zhì)荷比為10×103附近的豐度大大降低。

2.2.4 酶解4h時(shí)酶解液高效液相色譜圖結(jié)果

圖8 酶解4h時(shí)酶解液高效液相色譜圖Fig.8 HPLC chromatogram of 4 h Paphia undulate muscle hydrolysate

圖9 酶解4h時(shí)酶解液中陽(yáng)離子質(zhì)譜圖Fig.9 Mass spectra of 4 h Paphia undulate muscle hydrolysate

由圖8可知，酶解液入柱后，在酶解4h的第6、10、20、36分鐘附近處出現(xiàn)峰值。由圖9可知，這4個(gè)峰值當(dāng)碎片離子豐度最高時(shí)的質(zhì)荷比分別為411.2、413.2、474.5和516.3，且在這幾個(gè)質(zhì)荷比值的附近也存在其他豐度較高的數(shù)值，與酶解1、2、3h時(shí)酶解液譜圖相比較，此時(shí)的質(zhì)荷比的數(shù)值大大降低，都是在600以下，由此可知酶解4h時(shí)的酶解液絕大部分是小分子肽。2.2.5 酶解5h時(shí)酶解液高效液相色譜圖結(jié)果

圖10 酶解5h時(shí)酶解液高效液相色譜圖Fig.10 HPLC chromatogram of 5 h Paphia undulate muscle hydrolysate

A、B、C、D.保留時(shí)間分別為11、20、36、45min。

由圖10可知，酶解液入柱后，在酶解5h的第11、20、36、45分鐘附近處出現(xiàn)峰值。由圖11可知，這4個(gè)峰值當(dāng)碎片離子豐度最高時(shí)的質(zhì)荷比分別為520.3、437.8、463.2、618.5，且在這幾個(gè)質(zhì)荷比值的附近也存在其他豐度較高的數(shù)值，與酶解4h時(shí)酶解液譜圖相比較，此時(shí)的質(zhì)荷比的數(shù)值差別很小，由此可知酶解5h時(shí)的酶解液絕大部分也是小分子肽。

2.2.6 酶解6h時(shí)酶解液高效液相色譜圖結(jié)果

圖12 酶解6h時(shí)酶解液高效液相色譜圖Fig.12 HPLC chromatogram of 6 h Paphia undulate muscle hydrolysate

圖13 酶解6h時(shí)酶解液中陽(yáng)離子質(zhì)譜圖Fig.13 Mass spectra of 6 h Paphia undulate muscle hydrolysate

由圖12可知，酶解液入柱后，在酶解6h的第10、20、27、45分鐘附近處出現(xiàn)峰值。由圖13可知，這4個(gè)峰值當(dāng)碎片離子豐度最高時(shí)的質(zhì)荷比分別為502.2、480.5、488.3、509.2，與酶解4、5h時(shí)的酶解液譜圖相比較，此時(shí)的質(zhì)荷比的數(shù)值差別很小，由此可知酶解4h時(shí)是酶解的終點(diǎn)。

3 結(jié) 論

通過(guò)木瓜蛋白酶在 50℃、分別酶解時(shí)間1～6h、pH 6.3、加酶量1%、料水比1∶3的條件下酶解波紋巴非蛤肉漿，在SDS-PAGE電泳法測(cè)定的基礎(chǔ)上，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定波紋巴非蛤酶解的肽譜變化，可得酶解1h時(shí)酶解液的肽分子的分子質(zhì)量主要集中大概在100kD；酶解2h時(shí)酶解液的肽分子的分子質(zhì)量主要集中在40～65kD；酶解3h時(shí)分子質(zhì)量主要集中1.6～2.3kD；酶解4、5、6h時(shí)酶解液的肽分子的分子質(zhì)量基本沒(méi)變化，其分子質(zhì)量主要集中在400～600D，酶解4h時(shí)為酶解終點(diǎn)。

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Variations in Peptide Mass Fingerprints ofPaphia undulataMuscle Hdyrolysates during Enzymatic Hydrolysis

CHEN Xin1,2,3，CHEN Xiao-gang1，CHEN Jie-wen1，SUN Hui-li2,3
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Foshan University, Foshan 528000, China；2. South China Sea Institute of Oceanlogy, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China；3. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Paphia undulatemuscles were hydrolyzed with papain and the hydrolysates after hydrolysis for 1, 2, 3, 4, 5 h and 6 h were analyzed by SDS-PAEG and LC-MS/MS. The results revealed that the molecular mass distribution of peptides inPaphia undulatemuscle hydrolysates was mostly concentrated on 100, 50 kD and 2 kD during the first 3 hours of the hydrolysis,most of them large or small peptides. No substantial difference in the molecular mass distribution of peptides, which was mostly between 400 D and 600 D, was observed among the 4 h, 5 h and 6 h hydrolysates, suggesting that 4 h was the end point of the hydrolysis.

Paphia undulate；bioactive peptide；SDS-PAGE；LC-MS

Q556.3

A

1002-6630(2012)03-0048-06

2011-06-23

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BAD94B08)；廣東省2009院省合作項(xiàng)目(2009B091300018)；廣東省2010院省合作項(xiàng)目(2010B090900027)

陳忻(1968—)，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)楹Ｑ蠡瘜W(xué)。E-mail：fschenxin@tom.com