胡立娟，牛文彥

（天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，天津300070）

肥胖患者脂肪組織過度肥大，且先于血管生成造成局部脂肪組織缺氧，因此脂肪細(xì)胞處于慢性缺氧狀態(tài)。肥胖的脂肪組織伴有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，脂肪細(xì)胞自身及浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞可釋放大量炎癥因子，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化因子（MCP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等[1]，因此肥胖可視為一種慢性炎癥。慢性炎癥已成為2型糖尿病發(fā)病病因主要學(xué)說。最近有研究認(rèn)為缺氧是造成脂肪組織慢性炎癥的因素，本研究用1%O2、5%CO2、94%N2孵育脂肪細(xì)胞不同時(shí)間，檢測(cè)脂肪細(xì)胞表達(dá)的炎癥因子水平的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 3T3-L1脂肪細(xì)胞株 (由加拿大Amira Klip教授提供)，Hanks液、DMEM高糖（天潤(rùn)善達(dá)公司），胎牛血清（以色列 Bioind公司），胰島素、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤（IBMX）、地塞米松溶液（美國(guó)Sigma公司），偶聯(lián)HRP的山羊抗兔抗體（美國(guó)Jackson Immuno Research公司），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)試劑盒（美國(guó)PerkinElmer公司），高純總RNA提取試劑盒（北京百泰克公司）、cDNA合成試劑盒（北京天根公司）、Premix ExTaq酶、TaqDNA聚合酶、dNTPMixture、熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（Takara寶生物工程公司），引物合成（北京奧科生物技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 3T3-L1前脂肪細(xì)胞用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃5%CO2條件下培養(yǎng)至融合達(dá)80%，按密度為5×104/mL將細(xì)胞接種在培養(yǎng)板中，待生長(zhǎng)至完全融合后再生長(zhǎng)2 d進(jìn)行誘導(dǎo)分化，以下誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基均用高糖DMEM培養(yǎng)基配制，用含0.5mmol/L IBMX、lμmol/L地塞米松、5mg/L胰島素的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，再用含5mg/L胰島素的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，之后每2 d換含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基1次，約第14天達(dá)到90%以上為成熟脂肪細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞中出現(xiàn)串狀的脂肪滴。將細(xì)胞分為常氧組37℃1%O 5%CO 94%N2下孵育時(shí)間為4、8和16 h。

1.2.2 免疫印跡檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子1（GLUT1）的表達(dá) 常氧或缺氧培養(yǎng)脂肪細(xì)胞后，裂解細(xì)胞，測(cè)蛋白后取40μg裂解液，65℃加熱15min，7.5%(v/v)SDS-PAGE電泳，免疫印跡檢測(cè)GLUT1，一抗用抗GLUT1的兔抗體，二抗用偶聯(lián)HRP的山羊抗兔抗體，以Actinin1作內(nèi)參，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物試劑盒檢測(cè)，曝光，應(yīng)用NIH Image J軟件分析定量。

1.2.3 Real-time PCR法測(cè)定脂肪細(xì)胞 TNF-α、MCP-1mRNA水平 提取總RNA，取2μg合成cDNA第一鏈，取2μg cDNA產(chǎn)物及相應(yīng)上下游引物加入 12.5μLSYBR誖PremixEx Taq TM(2×)體系內(nèi)擴(kuò)增，條件為 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，57 ℃ 10 s，72 ℃34 s，40個(gè)循環(huán)，β-actin為內(nèi)參。TNF-α 上游引物為5′-CGTCGTAGCAAACCACCAA-3′；下游引物為 5′-GAGAACCTGGGAGTAGACAAGG-3′。MCP-1 上游引物為 5′-GCAGTTAACGCCCCACTCA-3′，下游引物為 5′-CCCAGCCTACTCATTGGGATCA-3′。β-actin上游引物為 5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′；下游引物為 5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧脂肪細(xì)胞GLUT1的表達(dá) 與常氧培養(yǎng)組相比，脂肪細(xì)胞不同時(shí)間缺氧培養(yǎng)后缺氧應(yīng)答基因GLUT1蛋白表達(dá)升高，4 h缺氧組為常氧組的（2.10±0.20）倍，8 h 缺氧組為常氧組的（4.20±0.30）倍，16 h缺氧組為常氧組的（5.57±0.68）倍，表明缺氧培養(yǎng)成功，見圖1。

圖1 不同時(shí)間缺氧培養(yǎng)脂肪細(xì)胞后GLUT1的表達(dá)Fig 1 Different incubation timeof hypoxia on theexp resion of GLUT1 in adipocytes

2.2 脂肪細(xì)胞TNF-α、MCP-1mRNA的表達(dá) 與常氧培養(yǎng)組相比，缺氧培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)升高，并且隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，4 h缺氧組為常氧組的（1.88±0.23）倍，8 h缺氧組為常氧組的（2.34±0.26）倍，16 h缺氧組為常氧組的（3.54±0.0.94）倍，不同時(shí)間的缺氧組與常氧組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。其中8 h缺氧組與4 h缺氧組相比，TNF-αmRNA表達(dá)升高，但差異卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.296），16 h缺氧組與4 h缺氧組相比，TNF-αmRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），16 h缺氧組與8 h缺氧組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。缺氧脂肪細(xì)胞比常氧脂肪細(xì)胞MCP-1mRNA表達(dá)升高，4 h缺氧組為常氧組的（2.24±0.52）倍，8 h缺氧組為常氧組的（2.43±0.35）倍，16 h缺氧組為常氧組的（3.66±0.77）倍，不同時(shí)間的缺氧組與常氧組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.016）。其中8 h缺氧組與4 h缺氧組相比MCP-1mRNA表達(dá)無差異，16 h缺氧組與4 h缺氧組相比，MCP-1mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），16 h缺氧組與8 h缺氧組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖3。

圖2 不同時(shí)間缺氧孵育后脂肪細(xì)胞TNF-α的基因表達(dá)Fig 2 Different incubation tim eof hypoxia on theexpresion of TNF-αin adipocytes

圖3 不同時(shí)間缺氧孵育后脂肪細(xì)胞MCP-1的基因表達(dá)Fig3 Different incubation tim eof hypoxia on theexpresion of MCP-1 in adipocytes

3 討論

肥胖是一種慢性低度炎癥，與糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、高胰島素血癥、心血管疾病等密切相關(guān)。肥胖相關(guān)性炎癥的發(fā)生與血清中炎癥因子，包括脂肪因子的異常密切相關(guān)。新近發(fā)現(xiàn)在肥胖小鼠的脂肪組織中存在局部缺氧和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，并且與炎癥因子的升高密切相關(guān)[2]。脂肪組織內(nèi)脂肪細(xì)胞及定居在其中的巨噬細(xì)胞分泌的IL-1、IL-6、MCP-1、TNF-α等炎癥因子釋放入血液可影響胰島素在其它靶組織中的作用。本研究用1%O2孵育脂肪細(xì)胞不同時(shí)間，造成脂肪細(xì)胞缺氧，研究缺氧孵育不同時(shí)間后脂肪細(xì)胞表達(dá)炎癥因子的變化。

GLUT1為基礎(chǔ)狀態(tài)下攝取葡萄糖的主要轉(zhuǎn)運(yùn)子，缺氧狀態(tài)下表達(dá)增高[3]。本研究通過檢測(cè)GLUT1蛋白的表達(dá)變化，驗(yàn)證缺氧處理的效果。缺氧4 h GLUT1蛋白的表達(dá)較常氧組明顯升高，并且缺氧時(shí)間越長(zhǎng)，升高越明顯，表明造成缺氧模型。肥胖動(dòng)物的脂肪組織在增長(zhǎng)的過程中，肥大的脂肪細(xì)胞的氧供應(yīng)相對(duì)減少，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞缺氧。在肥胖小鼠的脂肪組織，炎癥因子（TNF-α、IL-1、IL-6等）和巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子的基因表達(dá)增加，同時(shí)伴有缺氧反應(yīng)基因的增加，說明在肥胖小鼠的脂肪組織中存在慢性炎癥且與缺氧有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)缺氧孵育4 h的脂肪細(xì)胞與常氧培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞相比，游離脂肪酸（FFA）、TNF-α、MCP-1、IL-6明顯升高，脂聯(lián)素降低，證明缺氧導(dǎo)致脂肪細(xì)胞的炎癥發(fā)生。炎癥引起脂肪細(xì)胞自身胰島素抵抗，分泌FFA和多種炎癥因子，進(jìn)而影響其它胰島素靶組織骨骼肌和肝臟的胰島素敏感性，造成周身胰島素抵抗（insulin resistance，IR），最終導(dǎo)致2型糖尿病。因?yàn)槿毖踉斐傻氖锹匝装Y，因此本研究延長(zhǎng)缺氧時(shí)間，檢測(cè)長(zhǎng)時(shí)間的缺氧對(duì)脂肪細(xì)胞炎癥因子的影響。

TNF-α是具有多種生物活性的細(xì)胞因子，適量的TNF-α能殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬，抗感染，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化等，是機(jī)體免疫防護(hù)的重要介質(zhì)，對(duì)機(jī)體有利；而過量的TNF-α與其他炎癥因子一起產(chǎn)生多種病理損傷，脂源性和肌源性的TNF-α在肥胖所致外周胰島素抵抗的病理過程中起重要作用[4]。肥胖、胰島素抵抗的動(dòng)物脂肪組織TNF-α增高，中和TNF-α后，可以逆轉(zhuǎn)動(dòng)物的胰島素抵抗[5]。研究表明，伴IR的肥胖個(gè)體脂肪組織TNF-αmRNA表達(dá)及TNF-α分泌均增加，且與空腹血漿胰島素水平及體重指數(shù)呈正相關(guān)[6-7]，當(dāng)體重下降時(shí)，其表達(dá)水平隨之下降。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧處理的脂肪細(xì)胞TNF-α水平明顯升高，并且缺氧時(shí)間越長(zhǎng)，升高越明顯，說明長(zhǎng)時(shí)間缺氧比短時(shí)間缺氧造成脂肪細(xì)胞更嚴(yán)重的炎性反應(yīng)。

單核細(xì)胞趨化因子MCP-1在招募單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在飲食導(dǎo)致的肥胖早期MCP-1表達(dá)增加，因此MCP-1被認(rèn)為是招募巨噬細(xì)胞進(jìn)入脂肪組織的因子。高脂喂養(yǎng)MCP-1缺陷小鼠，脂肪組織的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)在一定程度上部分減少，并且胰島素敏感性得到改善[8]。本課題組已往的研究發(fā)現(xiàn)缺氧培養(yǎng)4 h的脂肪細(xì)胞條件培養(yǎng)基比常氧的脂肪細(xì)胞條件培養(yǎng)基造成更嚴(yán)重的骨骼肌胰島素抵抗，并吸引更多的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)[9]。本研究在此基礎(chǔ)之上，延長(zhǎng)缺氧孵育時(shí)間，發(fā)現(xiàn)16 h缺氧孵育的脂肪細(xì)胞MCP-1表達(dá)增加比4 h、8 h的升高更加明顯，與TNF-α表達(dá)水平相一致，因此筆者推測(cè)，長(zhǎng)時(shí)間的缺氧可引起脂肪細(xì)胞條件培養(yǎng)基含有更多的炎性因子。后續(xù)研究將延長(zhǎng)缺氧孵育脂肪細(xì)胞時(shí)間，收集條件培養(yǎng)基，檢測(cè)該條件培養(yǎng)基是否造成更嚴(yán)重的骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗。

綜上所述，缺氧處理的脂肪細(xì)胞比常氧條件下的脂肪細(xì)胞TNF-α和MCP-1的表達(dá)升高，并且缺氧時(shí)間越長(zhǎng)，升高越明顯。

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