陳 娜 ，王曉洋 ，杜 瑋 ，孫亞楠 ，李西川 ，馬振毅 ，劉 喆 ，3

（天津醫(yī)科大學1.基礎醫(yī)學研究中心，天津市醫(yī)學表觀遺傳學重點實驗室；2.生物化學與分子生物學教研室；3.免疫學教研室，天津300070）

在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)3種Shc基因：ShcA、ShcB、ShcC[1]。ShcA蛋白家族共有3個成員，分別是p46Shc，p52Shc，p66Shc[2]，他們都有一個 SH2 結構域，一個中心脯氨酸豐富區(qū)（CH1）和一個磷酸酪氨酸結合結構域（PTB），但p66Shc還含有一個獨特的N-端結構域(CH2)，位于該結構域的第36位絲氨酸是p66Shc活化的關鍵調控位點[3]，p66Shc正是通過此位點發(fā)揮抑制胰島素樣生長因子-I的功能[4]。越來越多的實驗證實p66Shc與腫瘤發(fā)生和轉移密切相關，p66Shc很可能是評價前列腺癌和冠狀動脈疾病預后好壞的有價值的生物標志物之一[5-6]，但詳細的作用機制仍需深入研究。如果在表達p66Shc的癌細胞中運用RNA干擾技術把p66Shc的表達水平下調，細胞會出現(xiàn)什么樣的生物學變化，此為進一步研究p66Shc蛋白的生物學功能進而深入探討腫瘤發(fā)生與轉移機制提供了又一研究工具。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱（Thermo），蛋白質電泳儀器（Bio-Rad），倒置熒光顯微鏡（上海長方光學儀器廠），低溫高速離心機（Eppendorf），酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo)。人非小細胞肺癌細胞株A549、Phoenix-293細胞來自本實驗室，培養(yǎng)條件：細胞在37℃、5%CO2、飽和濕度下用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。質粒pSuper.retro.puro（pSRP）和慢病毒包裝系統(tǒng)來自本實驗室，限制性內切酶來自NEB，E.coli DH5α和質粒提取試劑盒購于原平皓試劑有限公司，RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購于Hyclone，Trizol試劑、逆轉錄試劑盒和引物購自Invitrogen,Cell proliferation ELISA BrdU購自Roche，抗beta-actin和p66Shc抗體分別BD Biosciences Millipore抗鼠二抗購自Jackson Lab，底物Chemiluminescent HRPsubstrate購自Millipore。

1.2 pSRP-ip66Shc質粒的構建及其鑒定 根據哺乳動物真核細胞shRNA的Tuschl AA-19nt的設計原則，從p66Shc基因的mRNA序列中篩選1條shRNA靶序列，并合成相應的正義和反義DNA模板。利用Ambion shRNA在線軟件設計了針對p66Shc的shRNA：5′-GATCCCCCGGAATGAGTCTCTGTCATCGTTCAAGAGACGATGACAGAGACTCATTCCGTTTTTA-3′,3′-GGGGCCTTACTCAGAGACAGTAGCAGTTCTCTGCTACTGTCTCTGAGTAAGGCAAAAATTCGA-5′，用熒光素酶基因的shRNA-iluc作對照。將引物10000×g離心10min，加入水稀釋到3mg/mL，然后在25μL體系（TEpH8.0buffer）中，加入各1.5μL的引物，95℃3min，37℃退火1 h，最終至室溫。連接反應：用Bgl II和Hin d III酶切pSRP載體，割膠回收后的pSRP載體片段2μL，退火的DNA片段6μL，加入1μL 10×連接Buffer和 1μLT4 DNA Ligase，連接2 h，轉化入E.coli DH5α細胞中，得到轉化子pSRP-ip66Shc。質粒的鑒定：用Eco RI和Xho I酶切鑒定。

1.3 277-ip66Shc質粒的構建及其鑒定 用Eco RI酶切質粒pSRP-ip66Shc，再用T4 DNA polymerase補平缺口，純化后用Xho I酶切DNA片段，回收該DNA片段。用Eco RV和Xho I酶切277載體，割膠回收后備用。連接反應：回收的277載體片段2μL，DNA片段6μL，加入1μL 10×連接Buffer和1μL T4DNA Ligase，連接過夜。之后轉化入E.coli DH5α細胞中，得到轉化子277-ip66Shc。質粒的鑒定：用Bam HI和Xho I酶切鑒定。

1.5 A549細胞的感染 感染當天，A549細胞密度為60%~70%，棄去細胞液，加入含有polybrene(6 μg/mL)的病毒，12 h后觀察細胞狀態(tài)，如果沒有明顯的細胞毒性作用，48 h以后更換為正常培養(yǎng)基。如果有明顯的細胞毒性作用，馬上換為正常培養(yǎng)基；感染3 d后首先觀察GFP的表達情況，收集總蛋白進入后續(xù)Western Blot實驗。

1.6 半定量RT-PCR檢測p66ShcmRNA水平 總RNA抽取根據Invitrogen公司的Trizol操作說明書進行，均為RNase-free操作。在轉染后的35mm細胞培養(yǎng)板中加入1mL的Trizol，室溫放置5min，加入200μL氯仿，用力震蕩1min，室溫放置5min；4℃，12 000×g，20min離心；從每管中吸取上清至另一1.5mLEppendorf管，加入1/2體積-20℃預冷的異丙醇，混勻后-20℃沉淀20min；4℃，13 000×g離心20min后，去上清；加入1mL 4℃預冷的75%乙醇，洗滌沉淀及離心管壁；4℃，13 000×g離心5min，棄上清；加入50μLRNase-free水，至完全溶解。反轉錄反應：用反轉錄試劑盒將mRNA轉錄為cDNA。p66Shc引物F：CAGCCATGCCAGACTCAGGC，R：CACACACCAGACTGATGGCCT。GAPDH 引物 F：GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA，R：GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT，檢測p66Shc-shRNA在mRNA水平上的變化。

1.7 Western blot檢測p66Shc蛋白的表達水平 棄去細胞培養(yǎng)液，加入適量的預冷Laemmli sample buffer（62.5mmol/LTris-HCl,pH 6.8,25%glycerol，2%SDS，5%β-mercaptoethanoland 0.01%BromophenolBlue）；冰上裂解細胞10min，用預冷的刮刀將細胞刮下；超聲破碎細胞（200W共4次，每次3 s，間隔 3 s）；4℃，12 000×g，離心 5min；100℃加熱變性10min；SDS-PAGE:根據目的蛋白大小，采用Bio-Rad電泳裝置將總蛋白進行SDS-PAGE分離；電轉移：在4℃，200mA恒流條件下電轉移80min，將蛋白樣品轉移到NC膜上；封閉：用TBST(TBS+0.1%Tween-20)含5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；一抗孵育：用含有5%牛奶的TBST分別稀釋內參β-Actin一抗（1∶5 000）和 p66Shc一抗（1∶2 000），室溫下與封閉好的NC膜孵育2 h或4℃過夜；洗膜：TBST洗膜3次，每次5min；二抗孵育：用含有5%牛奶的TBST稀釋與一抗相應的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠二抗（1∶2 000），于室溫下孵育 1 h；洗膜：TBST 洗膜3次，每次10min；顯色反應：用Chemiluminescent HRPsubstrate作用在膜上3min，于暗房中曝光于X線底片上。

1.8 BrdU標記細胞增殖 以每孔1×103細胞數接種于96孔培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)1 d，加入BrdU（終濃度為10μmol/L），37℃，孵育 4 h；棄培養(yǎng)液，加入Fix Denat 200μL，室溫搖床孵育30min；棄上清，加入抗BrdU抗體（工作濃度1∶100），室溫搖床孵育1.5 h；棄上清，PBS洗滌3次；加底物反應5 min，再加入1mol/L H2SO4每孔25μL終止反應；用酶標儀檢測在波長為450nm、690nm（參考波長）的吸光度，重復10個孔。

2 結果

2.1 pSRP-ip66Shc和277-ip66Shc質粒的構建及其鑒定 將合成的shRNA引物退火后與Bgl II和Hin dⅢ酶切回收后的pSRP載體連接后做轉化；用Eco RI和Xho I酶切質粒pSRP-ip66Shc，經1%的瓊脂糖凝膠電泳，得到320bp的條帶，空載體得到250bp的條帶（圖1）。用Eco RI酶切質粒pSRP-ip66Shc，再用T4 DNA polymerase補平，純化后用Xho I酶切DNA片段，得到320bp條帶，然后回收該320bp的條帶。用Eco RV和Xho I酶切277載體，割膠回收后備用。連接277載體與回收的DNA片段，得到的質粒再用Bam HI和Xho I酶切，得到1條850bp的條帶，空載體得到1條530bp的條帶（圖2）。

圖1 pSRP-ip66Shc質粒的酶切鑒定Fig 1 Restriction enzym edigestion of pSRP-ip66Shc plasm id

圖2 277-ip66Shc質粒的酶切鑒定Fig 2 Restriction enzym edigestion of 277-ip66Shc plasm id

2.2 p66Shc的沉默效應

2.2.1 半定量RT-PCR檢測p66Shc的mRNA水平的變化 將轉染過病毒的對照組和shRNA病毒的細胞提取RNA，進行反轉錄，然后用p66Shc的引物和GAPDH引物做半定量PCR，實驗組的p66Shc的mRNA表達量比對照組明顯降低，而GAPDH表達沒有變化。多次重復實驗中，p66Shc-shRNA慢病毒對目標基因p66Shc在mRNA水平有明顯下調作用（圖3）。

圖3 半定量RT-PCR檢測p66Shc的mRNA水平Fig 3 Sem i-q RT-PCR detection of p66Shc mRNA level

2.2.2 Westernblot檢測p66Shc蛋白表達變化 Western blot檢測轉染后A549細胞的p66Shc的表達發(fā)現(xiàn)，加shRNA病毒的細胞比對照細胞表達p66Shc蛋白明顯減少，幾乎就沒有再表達p66Shc（圖4）。

圖4 Western blot檢測p66Shc蛋白表達Fig 4 W estern blot detection of p66Shc protein level

2.3 下調p66Shc之后影響細胞增殖 根據吸光值（450 nm吸光值減690 nm吸光值）分析細胞增殖結果。發(fā)現(xiàn)對A549細胞下調p66Shc之后細胞增殖明顯減少（圖5）。轉染277-ip66Shc的實驗組細胞增殖情況與轉染277-iluc對照組細胞相比，t=18.7，P<0.001。

圖5 BrdU實驗檢測細胞增殖Fig 5 BrdU detection of cellproliferation

3 討論

由于信號銜接蛋白ShcA對細胞的增殖、分化和凋亡起重要的調控作用，近年來引起了廣泛的關注。在小鼠中將p66Shc基因敲除可使小鼠減少糖尿病誘導的氧化應激反應從而抑制糖尿病腎病的發(fā)生[7]，提示p66Shc是一個氧化還原狀態(tài)的決定因子：在基因敲除p66Shc的小鼠中，巨噬細胞中的氧化物是減少的[8]。近年來也有研究發(fā)現(xiàn)p66Shc分布在粘著斑中，一旦細胞失去貼附的胞外基質，通過激活RhoA來介導失巢凋亡（一種特異的細胞脫離生長基質后而啟動的細胞凋亡）[9]。失巢凋亡對機體的正常發(fā)育至關重要，它可以確保脫離生長基質的細胞死亡,而耐受失巢凋亡的則是腫瘤細胞發(fā)生轉移的生物學基礎之一[10]。p66Shc可以通過降低Ras的活性來抑制癌細胞的轉移[11]。本研究通過構建針對p66Shc靶向的shRNA慢病毒載體，轉染到A549細胞中，從細胞的形態(tài)學、細胞的增殖、mRNA水平以及蛋白表達水平等幾個方面進行干擾前后的檢測對比，證實p66ShcRNA干擾后導致p66Shc的mRNA表達下調，同時抑制了p66Shc蛋白表達，進而減少了細胞的增殖，這說明細胞的增殖與細胞中p66Shc蛋白表達及其mRNA水平密切相關，同時也說明p66Shc參與的細胞信號傳遞途徑對腫瘤細胞的增殖起到重要的作用。本研究對進一步研究p66Shc功能及其信號傳遞途徑提供了有效的基因沉默研究工具，相關研究工作正在進行中。

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