郭開峰 曾 云

1（自貢市第四人民醫(yī)院 腫瘤科，自貢643000）

2（川北醫(yī)學(xué)院 藥理教研室，南充637007）

腫瘤研究者認(rèn)為腫瘤內(nèi)部含有一小部分具有自我更新、多向分化潛能的細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞［1－3］。這小部分細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥及放療抵抗的根源［2－4］。因此，分離并對其生物學(xué)特性進行研究對腫瘤的診斷、治療具有重要意義。本實驗選取結(jié)腸癌細(xì)胞株CW－2為研究對象，應(yīng)用無血清懸浮培養(yǎng)法初步獲得腫瘤干細(xì)胞，并對其進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株CW－2購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；RPMI1640 和DMEM／F12 培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胰酶購自Gibco公司；重組人表皮細(xì)胞生長因子（Recombinant Human Epidermal Growth Factor，EGF）、重組人白血病抑制因子（Recombinant Human Leukemia Inhibitory factor，LIF）、重組人堿性成纖維生長因子（Recombinant Human fibroblast growth factor－basic，bFGF）購自Sinobio公司；青霉素G、鏈霉素購自華北制藥股份有限公司；Anti－CD44－FITC、Anti－EpCAM－PerCP－Cy5.5和其同型抗體購自BD Bioscience公司。

2 方法

2.1 CW－2細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基（SSM）中常規(guī)培養(yǎng)

將CW－2細(xì)胞以105個／ml接種于含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基中。在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d換液。待細(xì)胞長滿瓶底約80%時傳代。

2.2 無血清懸浮培養(yǎng)富集CW－2干細(xì)胞

2.2.1 將在SSM 中處于對數(shù)增長期的細(xì)胞以105個／ml接種于無血清懸浮培養(yǎng)液（serum－free medium，SFM）中傳代培養(yǎng)。前14d直接向培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)液，14d后通過胰酶消化法和機械吹打法分離成單細(xì)胞懸液后傳代。每天觀察CW－2 細(xì)胞在SFM 中形成腫瘤干細(xì)胞球的過程。

2.2.2 向長滿瓶底80%的SSM 培養(yǎng)細(xì)胞直接換液為SFM，在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d換液，觀察其生長情況。

2.3 流式細(xì)胞檢測CD44、EPCAM 的表達

將含血清常規(guī)培養(yǎng)、無血清懸浮培養(yǎng)細(xì)胞球分別以106個／ml重懸于200μl PBS中，分別加入20 μl的Anti－CD 44－FITC和Anti－EPCAM－PerCP－Cy 5.5。對照組加入同型鼠IgG，避光孵育30 min，1000r／min離心5 min，棄上清，PBS洗2 次，離心棄上清，用200μl PBS 重懸細(xì)胞，上機分析。檢測CD 44＋EPCAM＋細(xì)胞比例。

2.4 細(xì)胞分化實驗

無血清懸浮培養(yǎng)14d，形成干細(xì)胞球后，向培養(yǎng)液中加入胎牛血清，觀察腫瘤干細(xì)胞球的生長情況。

2.5 細(xì)胞周期檢測

收集無血清懸浮培養(yǎng)前后的細(xì)胞懸液，1000r／min離心5min，棄上清，75%乙醇固定后加solution A 250μl，用手輕擊試管將細(xì)胞混勻，室溫下10min；加solution B 200μl，室溫下10min；加solution C 200 μl，混勻，2～8℃10min，上流式細(xì)胞儀檢測。

2.6 動物致瘤實驗

8只4－5周齡NOD／SCID 三聯(lián)免疫缺陷小鼠由四川大學(xué)實驗動物中心提供，雌雄各半。完全隨機分組法分別分成含血清培養(yǎng)組和無血清懸浮培養(yǎng)組，將含血清培養(yǎng)細(xì)胞和無血清懸浮培養(yǎng)細(xì)胞收集后調(diào)整至所需濃度，按1∶1比例與Matrigel混合，分別以104個細(xì)胞數(shù)量于右肩胛部皮下接種。每周2次觀察腫瘤生長狀況，4w 后將小鼠斷頸處死，照相后摘取皮下腫瘤。

3 結(jié)果

3.1 SFM 培養(yǎng)形成懸浮的腫瘤干細(xì)胞球

CW－2細(xì)胞接種于SFM 中，第2d大部分細(xì)胞貼壁，幾乎無死亡細(xì)胞（見圖1A），第7d時大部分細(xì)胞壞死、凋亡崩解，僅有少部分細(xì)胞存活下來并形成疏松的懸浮腫瘤干細(xì)胞球（見圖1B）。新形成的腫瘤干細(xì)胞球不規(guī)則，新生單個細(xì)胞以“出芽”的方式連接在球體上。第14d時細(xì)胞球明顯較第7d時更大、連接更緊密、不易準(zhǔn)確區(qū)分細(xì)胞與細(xì)胞間界限（見圖1C）。

3.2 流式細(xì)胞學(xué)檢測

流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)收集的無血清懸浮培養(yǎng)前后細(xì)胞懸液中干細(xì)胞含量。結(jié)果顯示無血清懸浮培養(yǎng)前后細(xì)胞中CD44＋EpCAM＋細(xì)胞含量分別為0.36%及60.39%（見圖2）。

3.3 細(xì)胞分化實驗

無血清懸浮培養(yǎng)14天，形成較大細(xì)胞球，向培養(yǎng)基中加入胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)第2天，懸浮的細(xì)胞球就出現(xiàn)貼壁生長（見圖3）。

3.4 體內(nèi)成瘤實驗

分別以104個細(xì)胞注入NOD－SCID 小鼠右肩胛皮下接種。腫瘤干細(xì)胞球組第9d可捫及腫瘤，后逐漸增大（見圖4），而SSM 組始終無腫瘤生長。摘取皮下腫瘤，計算成瘤體積，兩者之間的差距有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 無血清懸浮培養(yǎng)富集CD44＋EPCAM＋干細(xì)胞Fig.1 Suspended CD44＋EPCAM＋cancer stem cell spheres formed in SFM

圖2 流式細(xì)胞學(xué)檢測無血清懸浮培養(yǎng)前后細(xì)胞中CD44＋EPCAM＋細(xì)胞Fig.2 CD4＋EPCAM＋cancer stem cells were identified by Fluorescence－activated cell sorting

4 討論

近年來國內(nèi)外研究表明結(jié)腸癌中含一小部分具有自我更新、多向分化潛能的結(jié)腸癌干細(xì)胞，分離出這一小部分細(xì)胞是結(jié)腸癌干細(xì)胞的實驗室研究及結(jié)腸癌的臨床治療的關(guān)鍵［4－6］。

無血清條件能夠誘導(dǎo)非癌干細(xì)胞凋亡壞死，而癌干細(xì)胞卻能夠適應(yīng)該環(huán)境而長期的穩(wěn)定存活，并形成懸浮的細(xì)胞球，根據(jù)癌干細(xì)胞的這種生長特點，本實驗以結(jié)腸癌細(xì)胞株CW－2 為研究對象，參照Dalerba等［1］的方法，將CD44和EPCAM 作為結(jié)腸癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，運用流式細(xì)胞技術(shù)分離出具有干細(xì)胞特性的CD 44＋EPCAM＋細(xì)胞群，檢測無血清懸浮培養(yǎng)細(xì)胞初步富集結(jié)腸癌干細(xì)胞中結(jié)腸癌干細(xì)胞的含量。鑒于結(jié)腸癌干細(xì)胞具有高分化、高致瘤性，是結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)、侵襲、轉(zhuǎn)移的根源［5，6］，故本實驗進一步采用細(xì)胞分化實驗、體內(nèi)成瘤實驗對其進行鑒定。結(jié)果表明無血清懸浮培養(yǎng)可以獲得CD44＋EPCAM＋細(xì)胞含量為60.39%，顯著高于富集前的0.36%，該群細(xì)胞具有干細(xì)胞特性［7，8］。

綜上所述，無血清懸浮培養(yǎng)是簡單而有效的初步富集結(jié)腸癌干細(xì)胞的方法，為結(jié)腸癌干細(xì)胞的生物學(xué)性能研究奠定的理論與實踐基礎(chǔ)。

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