胡 松，張瑩瑩，秦 琴，趙佩瑩，畢建平，黃繼良

（江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

據(jù)WHO的報(bào)告，全球現(xiàn)有結(jié)核病人約2000萬(wàn)，結(jié)核病在世界很多地區(qū)流行，結(jié)核再次成為嚴(yán)重的世界性疾病［1］。結(jié)核分枝桿菌（Mycobacte?rium tuberculosis）屬胞內(nèi)寄生菌，在感染早期被巨噬細(xì)胞吞噬后，可抵抗宿主的殺傷，維持結(jié)核桿菌胞內(nèi)繁殖和擴(kuò)散，結(jié)核病的發(fā)生與發(fā)展與結(jié)核桿菌在巨噬細(xì)胞中的生存有直接關(guān)系。近來(lái)，結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁上的一種相對(duì)分子質(zhì)量19 ku（p19）的脂蛋白被證實(shí)可以對(duì)巨噬細(xì)胞中IFN-γ依賴的抗原遞呈途徑干擾［2］，p19是一種主要存在于結(jié)核桿菌細(xì)胞壁上的糖基化脂蛋白，被認(rèn)為是細(xì)菌毒力因子之一［3］，具有一定的免疫原性。該蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，激發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，其編碼基因存在于結(jié)核桿菌和卡介苗中，全長(zhǎng)為479 bp。

本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)克隆卡介苗中的脂蛋白19 ku編碼基因，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-p19，在大腸埃希菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)鎳柱純化后得到約為19 ku的融合蛋白，為實(shí)驗(yàn)后期進(jìn)一步研究做前期準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 大腸埃希菌DH5α與大腸埃希菌BL21為本室保存，卡介苗購(gòu)自武漢市疾控中心。原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a由江漢大學(xué)羅峰博士惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII、T4DNA連接酶、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermentas公司，玻璃奶膠回收試劑盒購(gòu)自博大泰克公司，蛋白質(zhì)純化層析樹(shù)脂（Ni-NTA）購(gòu)自GE公司，2X Taq Mix、DNA Marker DL6000、小量質(zhì)粒提取試劑盒、改良羅氏培養(yǎng)基購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.1.3 引物合成 引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 卡介苗基因組模板制備 卡介苗（No.2006120601）接種于改良羅氏培養(yǎng)基斜面上，37℃恒溫箱中培養(yǎng)4周，肉眼可觀察到淡黃色菜花狀菌落。挑取單個(gè)菜花狀菌落加入200 μL超純水水浴煮沸10 min，使其充分裂解，獲得卡介苗基因組模板。

1.2.2 PCR引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)Gen Bank中報(bào)道的p19基因序列結(jié)合所用載體設(shè)計(jì)引物，引物序列：上游：CGC GGA TCC GTG AAG CGT GGA CTG A；下游：CCC AAG CTT TTA GGA ACA GGT CAC CTC GAT T，其中在5’端分別引入BamHI、HindIII酶切位點(diǎn)。

1.2.3 目的基因的獲得 在50 μL反應(yīng)體系中，上、下游引物各4 μL，終濃度為0.4 μmol/L，卡介苗基因組模板 2 μL，2X Taq Mix 25 μL，超純水15 μL。置于PCR儀中，擴(kuò)增條件：95℃ 5 min—94℃ 45 s—55℃ 45 s—72℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)—72℃10 min。在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段，玻璃奶快速純化回收試劑盒進(jìn)行膠回收。

1.2.4 表達(dá)載體的構(gòu)建 用BamHI、HindIII雙酶切PCR回收產(chǎn)物和pET28a質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后玻璃奶快速純化回收試劑盒回收目的條帶，將p19目的條帶與pET28a質(zhì)?；厥债a(chǎn)物通過(guò)T4DNA連接，16℃過(guò)夜后，轉(zhuǎn)化宿主菌大腸埃希菌BL21（DE3），篩選陽(yáng)性重組子，用堿裂解法快速小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，正確的細(xì)菌命名為pET28a-p19。

1.2.5 p19序列分析 pET28a-p19大腸埃希菌工程菌中p19目的基因序列的測(cè)定由武漢華大基因公司完成，結(jié)果使用BLAST軟件比對(duì)。

1.2.6 pET28a-p19重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的pET28a-p19重組質(zhì)粒大腸埃希菌接種于5 mL的LB培養(yǎng)基（卡那霉素終濃度50 μg/mL）中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取1 mL過(guò)夜培養(yǎng)物接種入10 mL含卡那霉素（50 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩（180 r/min）培養(yǎng)至A600約0.6～0.8時(shí)，留取1 mL做對(duì)照，隨后加入IPTG（終濃度1 mmol/L），分別在加入IPTG后的第1、2、4、6小時(shí)取1 mL菌液，將菌液離心15 min，棄上清。

1.2.7 SDS-PAGE鑒定 將菌體沉淀內(nèi)加入100 μL 1X SDS蛋白質(zhì)上樣緩沖液，混勻后經(jīng)沸水水浴5 min，取20 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。以誘導(dǎo)前的BL21菌體裂解蛋白作對(duì)照，同時(shí)加入Fermentas蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，加于5%濃縮膠和12%分離膠中進(jìn)行SDS-PAGE電泳，100 V穩(wěn)壓，電泳2 h。凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G-250染色，再經(jīng)甲醇/冰乙酸脫色過(guò)夜，觀察結(jié)果。

1.2.8 p19蛋白純化 挑取鑒定正確的單個(gè)菌落，于37℃100 mL含卡那霉素LB培養(yǎng)液中過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)種于900 mL LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)1 h，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，4 h后離心收集、洗滌菌體，加入8 mol/L尿素溶解后超聲波裂解細(xì)菌，離心后取上清經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂柱純化，獲得融合蛋白。純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定，-20℃保存。

2 結(jié)果

2.1 p19基因PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

使用設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法從BCG基因組DNA中獲得特異性高的DNA片段，并且大小與預(yù)計(jì)相符，約為479 bp（圖1）。

圖1 19 ku脂蛋白PCR產(chǎn)物

2.2 pET28a-p19的構(gòu)建與鑒定

將目的基因與pET28a載體連接后，酶切鑒定及PCR鑒定均證實(shí)確有一大小為479 bp的片段插入載體，命名為pET28a-p19（圖2），對(duì)篩選的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序表明，與結(jié)核桿菌的p19基因完全一致。

圖2 pET28a-p19重組質(zhì)粒鑒定

2.3 重組pET28a-p19的表達(dá)

含重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸埃希菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，超聲裂解后取菌體裂解液經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色后，可見(jiàn)重組菌中表達(dá)了分子量約為19 ku的一條蛋白帶，在4 h表達(dá)量最佳（圖3），對(duì)照含空質(zhì)粒的大腸埃希菌則無(wú)此條帶。

2.4 p19蛋白純化

經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂柱純化后，獲得復(fù)性蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色，可見(jiàn)純化好的蛋白條帶（圖4）。

圖3 重組蛋白pET28a-p19的SDS-PAGE分析

圖4 純化重組蛋白pET28a-p 19的SDS-PAGE分析

3 討論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的傳染病，它危害人類健康歷史較長(zhǎng)。近年來(lái)，由于世界人口的劇增、腫瘤疾病的發(fā)生、結(jié)核菌株變異和耐藥性產(chǎn)生、HIV感染流行等種種原因，在世界上許多地方出現(xiàn)結(jié)核病發(fā)病率回升的現(xiàn)象，尤其是在包括我國(guó)在內(nèi)的發(fā)展中國(guó)家結(jié)核病發(fā)病率居高不下，已經(jīng)嚴(yán)重地制約社會(huì)發(fā)展和降低了人民生活水平。結(jié)核桿菌脂蛋白p19蛋白是存在結(jié)核桿菌菌體中的一種小分子蛋白，結(jié)核桿菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞后，可阻礙巨噬細(xì)胞遞呈抗原，使得結(jié)核桿菌進(jìn)入靜息狀態(tài)，但該過(guò)程影響機(jī)制尚不明確。結(jié)核桿菌p19蛋白可通過(guò)與Toll樣受體-2（Toll-like receptor 2，TLR-2）作用抑制IFN-γ在人巨噬細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)遞，從而使巨噬細(xì)胞表面HLA-DR類分子的表達(dá)減少，可減弱其抗原遞呈能力［4］，對(duì)結(jié)核桿菌在巨噬細(xì)胞中長(zhǎng)期存活具有重要作用。因此筆者認(rèn)為結(jié)核桿菌p19蛋白在結(jié)核桿菌形成靜息狀態(tài)中可能發(fā)揮加大作用，在研究該作用中結(jié)核桿菌p19蛋白的獲得是十分重要的步驟。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了可產(chǎn)生結(jié)核分枝桿菌19 ku脂蛋白的大腸埃希菌，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后與預(yù)期結(jié)果相符，其DNA序列經(jīng)測(cè)序和BLAST比對(duì)后也完全正確。由于表達(dá)載體pET28a上攜帶組氨酸標(biāo)簽（His Tag），它可通過(guò)含有鎳的蛋白層析樹(shù)脂進(jìn)行純化，通過(guò)該方法獲得了p19融合蛋白，并通過(guò)蛋白質(zhì)電泳鑒定正確。p19融合蛋白的成功獲得有助于進(jìn)一步研究p19蛋白通過(guò)Toll受體-2抑制巨噬細(xì)胞遞呈抗原的能力的相關(guān)機(jī)制。

［1］Small P M.Tuberculosis：a new vision for the 21st cen?tury［J］.Kekkaku，2009，84（11）：721-726.

［2］Singh P P，LeMaire C，Tan J C，et al.Exosomes re?leased from M.tuberculosis infected cells can suppress IFN-γ mediated activation of naive macrophages［J］.PLoS One，2011，6（4）：e18564.

［3］Alito A，McNair J，Girvin R M.Identification of Myco?bacterium boris antigen by anlysis of bovin T cell re?sponses after infection with a virulent strain［J］.Braz J Med Biol Res，2003，36：1523-1531.

［4］Cruz A，Khader S A，Torrado E，et al.Cutting edge：IFN-gamma regulates the induction and expansion of IL-17-producing CD4 T cells during mycobacterial in?fection［J］.J Immunol，2006，177（3）：1416-1420.