姚雪霞

（南京農(nóng)業(yè)大學 工學院，江蘇 南京210031）

分子動力學模擬研究活化劑對葡萄糖激酶活性的影響及活化機理

姚雪霞

（南京農(nóng)業(yè)大學 工學院，江蘇 南京210031）

葡萄糖激酶（GK）催化葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)?－磷酸葡萄糖，是糖代謝的第一步；GK的活性改變對葡萄糖的代謝影響很大.通過分子動力學模擬研究了葡萄糖激酶活化劑（GKA）對GK活性的影響，探討了GKA的活化機理.包結(jié)自由能分析表明，范德華作用是GK和GKA體系的主要驅(qū)動力；與此同時，葡萄糖使得GK和GKA的結(jié)合增強.構(gòu)象分析結(jié)果表明，GKA能夠在一段時間內(nèi)限制GK的構(gòu)象，但不能長久維持GK的活化構(gòu)象不變，這和以往的實驗結(jié)果相一致.相關(guān)理論分析結(jié)果不僅有利于從原子水平解釋GKA的活化機理，也可為設計新的用于糖尿病治療的GKA提供一定的理論參考.

葡萄糖激酶；活化劑；活性；活化機理；分子動力學模擬

葡萄糖激酶（GK）催化葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)?－磷酸葡萄糖，是糖代謝極為關(guān)鍵的一步，所以GK活性異常在糖代謝紊亂的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［1－2］.文獻［3］對GK的晶體結(jié)構(gòu)和催化過程進行了研究，認為GK存在三種構(gòu)象，即：關(guān)閉型、開啟型和超開啟型.其中，前兩種為活性構(gòu)象，第3種為非活性構(gòu)象.其催化過程如下：當血糖濃度較低時，GK主要以穩(wěn)定的超開啟構(gòu)象存在，當葡萄糖分子與之結(jié)合后，其構(gòu)象緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)殚_啟型構(gòu)象，然后轉(zhuǎn)變?yōu)殛P(guān)閉型構(gòu)象，在ATP存在下同時發(fā)生酶催化反應——葡萄糖磷酸化.反應結(jié)束后GK回復到開啟型構(gòu)象，同時釋放出6－磷酸葡萄糖（G6P）和ADP.若有新的葡萄糖分子結(jié)合則繼續(xù)發(fā)生磷酸化，進入快循環(huán)；若沒有新的葡萄糖分子結(jié)合，GK則轉(zhuǎn)變?yōu)槌_啟構(gòu)象，進入慢循環(huán).若GK的氨基酸殘基發(fā)生失活突變，則影響相應的催化過程，導致青年型早發(fā)糖尿?。∕ODY 2）［4］發(fā)生.為了治療MODY 2型糖尿病，以GK為靶點的小分子活化劑（GKA）的研究非?；钴S，并取得了很大的進展［5－9］.

觀察GK的晶體結(jié)構(gòu)［8］（如圖1所示），發(fā)現(xiàn)GK由448個氨基酸殘基構(gòu)成，折疊成大小不等的兩個結(jié)構(gòu)域，中間凹槽為連接域，葡萄糖分子磷酸化的活性位點位于該連接域內(nèi)，而GKA則位于GK的異構(gòu)點，距離葡萄糖底物大約2nm左右.雖然實驗已經(jīng)證實GKA可以提高GK的活性，但是還是有很多基本問題沒有解決.如，異構(gòu)點距離葡萄糖底物的距離為2nm左右，GKA如何提高GK的活性？文獻［10］雖然討論了其中一個GKA對GK的影響，但是還有很多細節(jié)問題沒有解決.如GKA是否一直對GK的構(gòu)象起著約束作用？另外葡萄糖的存在反過來對GKA有什么影響？以及其他GKA對GK的影響是否相同？為了解決這些疑問，很有必要對其他GKA對GK的活化機理做進一步的理論研究.

以往我們曾分析GK的活化突變對GK活性的影響［11－12］，發(fā)現(xiàn)它們主要通過約束GK的構(gòu)象來改變GK的活性.活化劑是否采用同樣的方式來改變GK的活性呢？為了研究GKA的活化機理，作者通過分子動力學（molecular dynamical，MD）模擬和 MM－PBSA（molecular mechanics／Poisson Boltzmann surface area）方法［13－14］，對GKA、GK以及葡萄糖的相互作用進行了理論研究.

1 理論與方法

1.1 蛋白質(zhì)構(gòu)建

由于第一個包含GK、GKA和葡萄糖復合物的晶體結(jié)構(gòu)［3］缺少實驗數(shù)據(jù)EC50值，因此本文作者選用了一個新研制出來的晶體結(jié)構(gòu)［8］作為研究對象.該體系和第一個體系相比，只有GKA不同，GKA的分子結(jié)構(gòu)如圖2所示.

GK－GKA－glucose復合體系的初始結(jié)構(gòu)取自于文獻（PDB code：3FR0）［8］.目前單獨的GK－glucose和單獨的GK－GKA晶體結(jié)構(gòu)還沒有文獻報道，因此單獨的GK－glucose和GK－GKA只能從復合體系中去掉另一個小分子作為初始結(jié)構(gòu).另外本文中所指的GK－free是指直接從GK－GKA－glucose復合體系中去掉GKA和葡萄糖兩個小分子得到的GK結(jié)構(gòu)，并不是真正的晶體結(jié)構(gòu)GK－free.

圖1 GK－活化劑－葡萄糖復合物的晶體結(jié)構(gòu)Fig.1 The crystal structure of GK in complex with GKA and glucose

圖2 GKA的分子結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structural formulas of the GKA

1.2 MD模擬

MD模擬的初始結(jié)構(gòu)如上所述.所有的MD模擬均采用AMBER 10程序包［15］.AMBER03力場用于蛋白質(zhì)分子，GAFF力場用于葡萄糖和GKA小分子.葡萄糖和GKA小分子都采用Gaussian 03程序包［16］的HF／6－31G＊基組優(yōu)化，采用RESP程序計算其電荷.程序LeaP用于中和體系，使其總電荷為零.

對于所有體系，均在溶質(zhì)外圍加上1nm的水分子層.采用周期性邊界條件和particle mesh ewald（PME）方法用于處理長程靜電作用［17］.非鍵截距為1.2nm，使用SHAKE選項用于約束和氫原子連接的鍵.

在運行MD之前，先進行兩步能量優(yōu)化：第一步約束溶質(zhì)，用最速下降法優(yōu)化5 000步，再用共軛梯度法優(yōu)化5 000步；第二步去約束后再優(yōu)化整個體系，用最速下降法優(yōu)化2 500步，再用共軛梯度法優(yōu)化2 500步，收斂條件為能量梯度小于4.18×10－4kJ·mol－1·nm－1.

MD模擬分為兩步：首先進行200ps的約束溶質(zhì)分子MD模擬，即通過200ps預熱，將體系從0K加熱到300K；然后進行10ns無約束恒溫MD模擬，溫度為300K，壓力為1×105Pa（即NPT系綜）.系統(tǒng)的溫度和壓力則通過Langevin piston和Hoover’s thermostat實現(xiàn)控制.模擬中采用的積分步長為2fs，非鍵連接表每50步更新一次.每4ps保存一次軌跡結(jié)構(gòu)用于后期數(shù)據(jù)處理.

2 結(jié)果與討論

2.1 MD軌跡穩(wěn)定性的分析

體系在模擬過程中產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)相對于晶體結(jié)構(gòu)隨時間變化的均方根偏差（RMSD）是衡量體系是否穩(wěn)定和達到收斂的重要依據(jù).為了檢測MD軌跡的穩(wěn)定性，分別對GK－free，GK－GKA，GK－glucose和 GK－GKA－glucose四個軌跡中GK的Cα原子進行RMSD分析，結(jié)果如圖3所示.分析圖3，發(fā)現(xiàn)相比于其他軌跡，GK－free的軌跡RMSD值最大，最不穩(wěn)定.而GK－glucose和GK－GKA－glucose的RMSD值比較小，軌跡相對穩(wěn)定一些.但是仔細分析，發(fā)現(xiàn)GK－GKA－glucose的軌跡最穩(wěn)定.這表明GKA的存在，可以使得GK－glucose體系更加穩(wěn)定.

2.2 GKA和GK之間靜電作用的分析

分析其晶體結(jié)構(gòu)（如圖1所示），可以看到GKA處于GK背部的空腔內(nèi)，不僅和GK有非鍵的范德華作用，而且還有氫鍵作用.晶體結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的氫鍵，在動態(tài)的MD過程中會有什么變化？下面分別討論兩種MD情況下GK和GKA之間的氫鍵隨時間的變化：（1）GK和GKA單配體作用.從圖4（A）中可以看到其中的兩個氫鍵非常穩(wěn)定，只有第三個氫鍵不太穩(wěn)定，在MD運行到3ns附近發(fā)生斷裂，在6ns左右又重新形成；（2）GK和GKA、葡萄糖雙配體作用.分析三個氫鍵距離隨模擬時間的變化，可以發(fā)現(xiàn)在整個MD過程中，三個氫鍵都非常穩(wěn)定.由于以上兩種情況下MD模擬參數(shù)都完全相同，唯一的區(qū)別在于第二種情況下含有葡萄糖小分子.因此我們可以得出這樣的結(jié)論，即葡萄糖的存在使GK和GKA的結(jié)合更加穩(wěn)定.這和文獻報道［3］一致，即GKA可以提高GK對葡萄糖的活性，同時葡萄糖的存在，反過來又可以促進GK和GKA的結(jié)合.迄今為止，還沒有發(fā)現(xiàn)在沒有葡萄糖存在的條件下，GK和GKA單配體結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，這也說明GK單獨和GKA在一起是不能長期穩(wěn)定存在的.

圖3 GK Cα原子在10ns MD模擬過程中的RMSD軌跡Fig.3 The RMSD trajectories of Cαatoms of GK during 10ns MD simulations

圖4 GK和GKA之間的氫鍵鍵長隨時間的變化Fig.4 Time evolution of three hydrogen bond lengths between GK and GKA

2.3 GKA和GK之間包結(jié)自由能的分析

通過MM－PBSA方法［11］計算了兩個模擬體系 （GK－GKA和GK－GKA－glucose）中GKA和GK之間的相互作用能，結(jié)果如表1所示.分析計算結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不論是哪一種模擬體系，GK和GKA之間的主要作用力都是范德華力.盡管GK和GKA之間真空下的靜電作用能為負值，但是極性的溶劑化能卻是一個更大的正值，導致它們之間總的靜電作用能為正值，不利于GK和GKA的穩(wěn)定結(jié)合.通過能量計算表明，GKA主要是通過范德華力和GK結(jié)合在一起.

表1 GK和配體的包結(jié)自由能 （kJ·mol－1）aTable 1 Binding free energy of the ligands and GK

另外分析GK－GKA和GK－GKA－glucose兩個體系的能量差別，發(fā)現(xiàn)葡萄糖的存在，使得GK和GKA之間的能量變得更低.具體分析各個能量項，發(fā)現(xiàn)主要的差別不是范德華力，而是靜電作用力.葡萄糖的存在使得GK－GKA之間的靜電作用能變低，最終導致總的包結(jié)能降低.以上的計算結(jié)果和文獻報道［3］一致，即葡萄糖可以促進GK和GKA的穩(wěn)定結(jié)合.

2.4 GKA對GK構(gòu)象影響的分析

前面我們分析了GK和GKA之間的主要作用力.下面將分析GKA對GK構(gòu)象的影響.首先分析GKA對GK夾角的影響（如圖5所示）.從圖5中可以看到對于GK－free，大小域的夾角在開始的1ns變化很大，從15°迅速增加到30°左右.隨后，GK－free夾角的值趨于穩(wěn)定，說明GK達到一種相對較穩(wěn)定的構(gòu)象.GK－free夾角的這種變化趨勢和其RMSD的變化趨勢相一致，從圖3中可以看到，其RMSD值在開始的1 ns上升非?？?，迅速達到3nm后趨于穩(wěn)定.和GK－free相比，加了GKA以后，GK大小域的夾角和初始結(jié)構(gòu)夾角相比，變化較小.從圖5中可以看到，在整個5ns時間內(nèi)，夾角的值比較穩(wěn)定，在18°左右波動.因此可以得出GKA對GK的構(gòu)象變化確實起到了一種門閂的作用，約束著GK大小域的開合.但是5ns以后，我們發(fā)現(xiàn)GKGKA體系的夾角從18°增加到22°.以上結(jié)果表明GKA可以在一段時間內(nèi)約束GK的構(gòu)象，使之處于活化狀態(tài)，但不能一直保持GK的構(gòu)象不變，這和以往的實驗結(jié)果是一致的［3］.

為了進一步研究GKA對GK構(gòu)象的影響，分別用動態(tài)相關(guān)性矩陣（Dynamic cross－correlation matrices，DCCM）［18－19］分析了四種MD情況下GK 448個氨基酸殘基內(nèi)部的相關(guān)性，如圖6所示.DCCM最吸引人的地方在于預測一些非相鄰的氨基酸之間的動態(tài)相關(guān)性，也就是我們通常所說的蝴蝶效應，這是靜態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)無法提供的.因此DCCM已被廣泛用于蛋白質(zhì)動態(tài)相關(guān)性分析［18－19］，并取得了很好的預測效果.

圖5 GK－free和GK－GKA的夾角隨時間的進展圖Fig.5 Cleft－angle profiles along the GK－free and GK－GKA trajectories

圖6 GK的DCCM動態(tài)相關(guān)性分析Fig.6 DCCM illustrating the correlation of motion between residues in GK

圖6 （A）為GK－free的DCCM 圖，從圖6（A）可以看到，大部分氨基酸殘基的相關(guān)性很小，顏色以淺藍色和綠色為主，很小的黃色區(qū)域表示該區(qū)域的氨基酸殘基之間存在正的相關(guān)性.另外還存在一些很小的藍色區(qū)域，表示該部分殘基之間的負相關(guān)性較強.

和GK－free相比，GK－GKA的氨基酸殘基負相關(guān)性非常明顯，部分區(qū)域的顏色顯示為深藍色（如圖6（B）所示）.仔細分析，我們發(fā)現(xiàn)GK 300～400的氨基酸殘基和100～150的氨基酸殘基之間有很明顯的負相關(guān)性.進一步分析晶體結(jié)構(gòu)（如圖7所示），發(fā)現(xiàn)300～400的氨基酸殘基位于GK的大域，而100～150的氨基酸殘基位于GK的小域，它們之間相距甚遠.在沒有GKA存在的情況下，它們之間并沒有負相關(guān)性運動，但是在GKA存在的情況下，這種負相關(guān)運動則非常明顯.表明GKA可以影響GK大小域的開合運動.這和我們前面分析GKA對GK夾角的影響是一致的.

GK－glucose的DCCM如圖6（C）所示.分析圖6（C）發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖存在的情況下，GK的正負相關(guān)性運動都非常不明顯，可忽略不計.我們推測是因為GK和葡萄糖的強烈靜電作用，導致GK的構(gòu)象非常穩(wěn)定，所以觀察不到GK的相關(guān)性運動.

最后一個DCCM圖用來說明GK－GKA－glucose的氨基酸殘基的相關(guān)性運動（見圖6（D））.分析圖6（D）發(fā)現(xiàn)，GK－GKA－glucose的負相關(guān)性介于GK－GKA和GK－glucose之間.我們推測是因為葡萄糖和GK的相互作用，導致GKA對GK的負相關(guān)性影響減小.

以上DCCM分析和作者以前所研究的Y214C［11］和M197V［12］活性突變的DCCM結(jié)果基本相同.表明該活化劑的作用類似于GK本身的一些活性突變，都是通過約束GK的構(gòu)象來提高GK的活性.

圖7 GK（綠色），殘基ID：100～150（紅色）和殘基ID：300～400（紫色）Fig.7 GK （green），RES ID：100～150（red）and RES ID：300～400（purple）

3 結(jié)論

通過分子動力學模擬分析了GKA和GK的相互作用.包結(jié)自由能分析表明，范德華作用是GK和GKA體系的主要驅(qū)動力.同時葡萄糖的存在使得GK和GKA結(jié)合得更加穩(wěn)定.構(gòu)象分析表明，GKA可以在一段時間約束GK的構(gòu)象，但是不能一直維持GK的活化構(gòu)象不變，這和以往的實驗結(jié)果相一致.本研究從原子水平解釋了GKA的活化機制，為今后設計新的GKA小分子提供了一定的理論參考.

致謝：南京大學理論與計算化學研究所提供計算機服務器用于計算.

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Effect of activator on activity of glucokinase and activation mechanism of the activator—study by molecular dynamics simulation

YAO Xuexia
（College of Engineering，Nanjing Agricultural University，Nanjing210031，Jiangsu，China）

Glucokinase（GK）is a glycolic enzyme that catalyzes the phosphorylation of glucose to glucose－6－phosphate in the first step of glycolysis，and the change in GK activity plays an important role in abnormal glycemia.Thus molecular dynamics simulation was performed to study the effect of glucokinase activator（GKA）on the activity of GK，and the activation mechanism of GKA was examined.The binding free－energy analysis suggests that van der Walls forces are the main driving forces for GK－GKA complex，and glucose can enhance the binding between GK and GKA.Moreover，conformation analysis shows that GKA can constrain the conformation of GK in a period of time，but it cannot keep the active state of GK in an extended period，which is in agreement with previously reported experiment results.These observations are beneficial to understanding the activation mechanism of GKA at an atomic level and to guiding the design of novel GKA for the treatment of diabetes.

glucokinase；activator；activity；activation mechanism；molecular dynamic simulation

O 629.8

A

1008－1011（2012）04－0091－06

2011－12－20.

江蘇省農(nóng)機局科研啟動基金資助項目（gxz10008）.

姚雪霞（1975－），女，講師，研究方向為物理化學.E－mail：yaoxx0623＠sina.com.