劉達(dá)玉，鄒 強(qiáng)，王 衛(wèi)

(成都大學(xué)，食品加工四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610106)

蛋白質(zhì)微膠囊對(duì)益生菌包埋的最新研究進(jìn)展

劉達(dá)玉，鄒 強(qiáng)，王 衛(wèi)*

(成都大學(xué)，食品加工四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610106)

蛋白質(zhì)作為食品體系中的主要成分，具有多種優(yōu)良的理化特性。將其作為益生菌的包埋壁材，不僅可以提高益生菌在不良環(huán)境中的存活率，還可以用于益生菌腸道定位釋放的載體。綜述了蛋白質(zhì)在益生菌包埋方面的應(yīng)用原理及其最新進(jìn)展。

蛋白質(zhì)，益生菌，包埋

益生菌對(duì)外界的不利環(huán)境極易敏感，從下游加工到最終食用過程中有許多因素會(huì)影響益生菌的存活率(圖1)。越來越多的增效技術(shù)被用來提高益生菌的耐受性，其中包括預(yù)培養(yǎng)、篩選抗性菌株、添加保護(hù)劑和包埋［1］。相比于其它三種方法，益生菌的包埋是最常采用的和最為有效的方法。通過包埋技術(shù)，益生菌細(xì)胞周圍形成一個(gè)致密的物理屏障，這將有助于抵御或者延緩空氣、胃酸、膽鹽等有害物質(zhì)的滲透，從而降低不利環(huán)境對(duì)細(xì)胞的損害作用。益生菌包埋中最常用的壁材是海藻酸鈉，它的優(yōu)點(diǎn)是:廉價(jià)、適用、生物相容性高，另外它具有形成離子型膠體的能力，這種膠體在低酸環(huán)境下很穩(wěn)定，在中性或更高的pH環(huán)境中又能溶解。但是由于海藻酸鈉膠體多孔的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使得它并不能完全有效地限制小分子有害物質(zhì)的滲透，所以它對(duì)益生菌的保護(hù)效果也非常有限。另外，海藻酸鈉膠體在有其它螯合劑或者非凝膠型金屬離子存在下會(huì)變得不穩(wěn)定［2］。蛋白質(zhì)是一種營養(yǎng)價(jià)值很高的天然聚合物，它優(yōu)良的乳化、凝膠、起泡和持水能力使得它成為食品中最重要的組分［3－4］。更重要的是，蛋白質(zhì)許多優(yōu)良的理化性質(zhì)非常適用于益生菌的包埋，并且，以它為壁材的益生菌包埋體系已被越來越多的研究人員所開發(fā)。本文主要綜述了以蛋白質(zhì)為壁材包埋益生菌的原理、方法和強(qiáng)化手段。

圖1 從下游加工到最終食用過程中影響益生菌存活率的主要因素Fig.1 Themain factors affecting survival rate of probiotics

1 蛋白質(zhì)作為益生菌包埋壁材的優(yōu)點(diǎn)

通過酶、酸以及鈣離子的交聯(lián)作用，蛋白質(zhì)能夠在室溫下形成結(jié)構(gòu)致密的凝膠，并且反應(yīng)條件溫和，這將有利于蛋白質(zhì)對(duì)那些極易失活的生物活性成分進(jìn)行包埋。相比于球蛋白分子中帶負(fù)電的基團(tuán)，帶正電的氨基能產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電斥力，因此當(dāng)環(huán)境處于較高pH時(shí)，如:pH＞蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(p I)，蛋白質(zhì)膠體中的生物活性成分快速釋放;當(dāng)環(huán)境處于較低pH時(shí)(pH＜p I)，釋放速度則相對(duì)較慢［5］，這就意味著對(duì)于那些對(duì)酸敏感并需要腸道釋放的生物活性成分來說，蛋白質(zhì)作為包埋壁材是一種不錯(cuò)的選擇。象乳清蛋白的蛋白質(zhì)，它們具有即親水又親油這樣的天然性質(zhì)，所以它們能夠快速吸附到乳化液滴表面，并通過分子重排和聚集使得乳化液滴表面形成一層連續(xù)且均勻的蛋白質(zhì)膜，這層致密的膜能夠有效地保護(hù)分散于乳化液滴內(nèi)的生物活性成分［6－7］。另外，牛乳中的蛋白質(zhì)都具有一定的pH緩沖能力，將牛乳加入到模擬胃液中能夠提高環(huán)境的pH從而增加益生菌在胃酸中的存活率［8－9］。綜上所述，也正是由于蛋白質(zhì)這些優(yōu)良的特性，使得蛋白質(zhì)成為了極具前景的益生菌包埋壁材。

2 以蛋白質(zhì)為壁材的益生菌包埋方法

目前，以蛋白質(zhì)為壁材包埋益生菌的方法主要有三種，它們分別是:噴霧干燥、擠壓和乳化。

2.1 噴霧干燥

雖然噴霧干燥很少用于熱敏性生物活性成分的包埋，但是通過控制工藝條件(進(jìn)風(fēng)溫度、出風(fēng)溫度和進(jìn)料速度等)，益生菌細(xì)胞能夠成功地通過噴霧干燥包埋于蛋白質(zhì)基質(zhì)中。用于益生菌噴霧干燥的蛋白質(zhì)壁材主要是牛乳中的蛋白(酪蛋白和乳清蛋白)和明膠。在噴霧干燥過程中，這些蛋白質(zhì)通過穩(wěn)定細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)來保護(hù)細(xì)胞免受損傷，并且通過蛋白質(zhì)的成膜特性，使得益生菌細(xì)胞包埋于蛋白質(zhì)微膠囊中［10］。噴霧干燥方法中蛋白質(zhì)的進(jìn)料類型有兩種:蛋白質(zhì)水溶液和蛋白質(zhì)乳化液(圖2)。對(duì)于蛋白質(zhì)水溶液的噴霧干燥，脫脂乳是一種最為合適的蛋白質(zhì)基質(zhì)，這是因?yàn)樗渲械睦业鞍缀托》肿尤樘菍?duì)細(xì)胞壁具有最好的穩(wěn)定作用，另外它較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度將有利于提高益生菌在儲(chǔ)藏過程中的穩(wěn)定性［11－13］。但是，在模擬胃液和膽鹽中，脫脂乳對(duì)菌的保護(hù)效果卻不如明膠好［14］。通過干燥蛋白質(zhì)乳化液，能夠使分散有益生菌的乳化油滴表面覆蓋了一層水不溶性的蛋白質(zhì)膜，在這種蛋白質(zhì)微膠囊中，油相作為一種疏水性物質(zhì)，它能有效抵御氫離子、有機(jī)酸、水和氧氣的擴(kuò)散作用［15－16］;同時(shí)，在乳化過程中，蛋白質(zhì)分子將自己的疏水性氨基酸重排于油相，使得這些氨基酸被掩蓋起來，從而不利于胃蛋白酶的水解作用，因?yàn)槲傅鞍酌杆獾奶禺愋晕稽c(diǎn)都是一些疏水性的氨基酸［4，7］。但不足的是，這個(gè)包埋方法需要先將微細(xì)化的菌粉均勻地分散于油相中，而菌粉的微細(xì)化既復(fù)雜又費(fèi)時(shí)，并且還會(huì)產(chǎn)生對(duì)菌有破壞作用的熱量［17］。除此之外，Picot等［18］還發(fā)現(xiàn)相比于噴霧干燥蛋白質(zhì)乳化液，直接噴霧干燥蛋白質(zhì)水溶液對(duì)菌的損傷作用較小。

2.2 擠壓

一些球蛋白在熱變性展開之后，通過調(diào)節(jié)pH和離子強(qiáng)度能夠在室溫下形成凝膠。基于這種原理，可以將熱變性后的球蛋白擠壓到固化液(醋酸鹽緩沖液和氯化鈣溶液)中來實(shí)現(xiàn)益生菌的包埋。目前，已有研究采用注射器將分散有益生菌細(xì)胞的乳清蛋白溶液滴入到氯化鈣溶液中來形成蛋白質(zhì)膠球。這膠球不僅能夠在模擬胃腸道中對(duì)益生菌提供保護(hù)作用，還能提高益生菌在食品加工(加熱和冷凍)和食品儲(chǔ)藏(餅干、果汁、蔬菜汁)過程中的存活率［19－21］。但是蛋白質(zhì)交聯(lián)鈣的能力卻不如海藻酸鈉，所以用于蛋白質(zhì)形成凝膠所需的氯化鈣濃度通常是海藻酸鈉形成凝膠所需濃度的15倍，而高濃度的氯化鈣溶液對(duì)益生菌有致死作用。另外，這種方法制備得到的膠球直徑通常都超過3mm，添加到食品中會(huì)影響食品的食味品質(zhì)。為了解決上述缺點(diǎn)，Doherty等［22］通過振動(dòng)式噴嘴將分散有益生菌的乳清蛋白溶液擠壓到醋酸鹽緩沖液中，另一方面為了降低表面張力，吐溫20被加入到醋酸鹽緩沖液中，這種方法制備得到的蛋白質(zhì)微膠囊粒徑可以控制在200μm左右。通過平板技術(shù)和熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)該包埋操作對(duì)菌幾乎沒有任何不良影響。并且這些微膠囊在3h的模擬胃液中表現(xiàn)出較高的酸穩(wěn)定性和胃蛋白酶穩(wěn)定性，之后由于高pH和胰蛋白酶的協(xié)同作用導(dǎo)致它們?cè)谀M腸液中快速崩解，從而將包埋的菌全部釋放于模擬腸液中(圖3)。

圖2 益生菌噴霧干燥包埋方法的流程圖Fig.2 Flow diagram ofmicroencapsulation of probiotics by spray－drying

圖3 益生菌擠壓包埋方法的流程圖Fig.3 Flow diagram ofmicroencapsulation of probiotics by extrusion

2.3 乳化

在乳化的包埋方法中，首先要將分散有益生菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)溶液加入到大量的植物油中，待形成穩(wěn)定且大小均勻的W/O乳化液之后，才讓蛋白質(zhì)乳化液滴在交聯(lián)劑的作用下形成凝膠顆粒。根據(jù)交聯(lián)劑的類型可將乳化包埋方法分為兩種:內(nèi)源乳化凝膠和外源乳化凝膠(圖4)。前者是在乳化操作之前先將交聯(lián)劑加入到蛋白質(zhì)和菌的懸液中，在形成乳化液之后，蛋白質(zhì)分子在交聯(lián)劑的作用下緩慢地形成凝膠。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶能夠催化蛋白質(zhì)分子發(fā)生酰胺轉(zhuǎn)移反應(yīng)，通過這種反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子之間能夠形成共價(jià)型的交聯(lián)。Heidebach等［23］開發(fā)了一種以轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶為交聯(lián)劑，通過乳化內(nèi)源凝膠包埋益生菌的方法。如果降低蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力，蛋白質(zhì)分子也能相互聚集并形成非共價(jià)性的交聯(lián)。凝乳酵素能將伸出酪蛋白膠束表面的κ－酪蛋白從上面切除掉，κ－酪蛋白帶負(fù)電，它的切除有利于降低酪蛋白膠束的負(fù)靜電斥力。因此凝乳酵素也被用作乳化內(nèi)源凝膠系統(tǒng)中包埋益生菌的交聯(lián)劑。在整個(gè)過程中，最關(guān)鍵的一步是通過溫度來控制凝膠反應(yīng):在形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)乳化液之后，快速地將體系的溫度從5℃提升到18℃以上，因?yàn)樵?8℃以下，凝乳酵素不會(huì)使酪蛋白溶液凝結(jié)，但當(dāng)溫度提高到18℃以后，凝乳酵素就能重新發(fā)揮作用使酪蛋白乳化液滴轉(zhuǎn)化為膠粒［24］。另外，葡萄酸內(nèi)酯通過緩慢降低蛋白質(zhì)溶液的pH來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子間形成非共價(jià)性交聯(lián)。Nag等［25］將這種交聯(lián)劑運(yùn)用到乳化內(nèi)源凝膠體系中對(duì)益生菌進(jìn)行包埋，但在他們的方法中需要向酪蛋白溶液中加入結(jié)冷膠，因?yàn)榻Y(jié)冷膠和酪蛋白能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，這種協(xié)同作用主要體現(xiàn)在提高膠體的凝膠強(qiáng)度和膠體對(duì)高pH環(huán)境的穩(wěn)定性上。對(duì)于乳化外源凝膠方法，辛尼品是一種主要采用的交聯(lián)劑，它能與多個(gè)蛋白質(zhì)分子中賴氨酸殘基上的氨發(fā)生非共價(jià)性的結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián);除此之外，它還能夠在形成W/O乳化液之后直接加入到油相促使蛋白質(zhì)乳化液滴從外部開始形成凝膠。Annan等［26］發(fā)現(xiàn)辛尼品含量超過0.01mol/L后，增加辛尼品含量并不能提高明膠微膠囊的粒徑和對(duì)菌的保護(hù)效果，相反卻能提高微膠囊對(duì)模擬胃液的穩(wěn)定性［27］。但是，由于辛尼品的交聯(lián)作用會(huì)使蛋白質(zhì)膠囊產(chǎn)生黑藍(lán)色的外觀，這將不利于蛋白質(zhì)膠囊添加到食品中。

圖4 益生菌乳化包埋方法的流程圖Fig.4 Flow diagram ofmicroencapsulation of probiotics by emulsification

3 蛋白質(zhì)作為益生菌包埋壁材的缺點(diǎn)

蛋白質(zhì)作為益生菌包埋壁材的缺點(diǎn)主要有兩個(gè):第一，它能被胃蛋白酶水解，使得包埋的益生菌提前釋放于胃液中，從而失去對(duì)益生菌的保護(hù)作用。Chen等［3］發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)微膠囊在胃液中的降解速度非?？欤诓坏?h的時(shí)間內(nèi)，幾乎所有的微膠囊都消失了，使得包埋的核黃素全部釋放于模擬胃液中;第二，蛋白質(zhì)膠粒容易相互粘接在一起形成聚集體，這些形狀多變的聚集體在水中很難被分散開。這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子中有一些疏水性的基團(tuán)，蛋白質(zhì)膠粒通過疏水性聚集來降低這些基團(tuán)的表面張力，或者是因?yàn)樗嘀写嬖诘拟}和其它金屬離子能夠降低蛋白質(zhì)膠粒之間的靜電斥力，并在它們之間形成鹽橋，這樣就促進(jìn)了蛋白質(zhì)膠粒的聚集［28－29］。

4 基于蛋白質(zhì)的強(qiáng)化手段

4.1 添加其它輔助物質(zhì)

向明膠微膠囊中加入一些可代謝的糖類能夠提高它們對(duì)益生菌的保護(hù)效果，例如:麥芽糖。因?yàn)樵谌榛瘍?nèi)源凝膠過程中，明膠和麥芽糖會(huì)發(fā)生相分離，使得在明膠凝膠基質(zhì)內(nèi)形成許多分散有益生菌細(xì)胞的麥芽糖包含體，這樣的結(jié)構(gòu)將有助于延緩酸液滲透進(jìn)入包含體內(nèi)破壞細(xì)胞;另外，處于包含體內(nèi)的益生菌細(xì)胞能夠更好地接觸碳源，通過代謝這些碳源能夠?yàn)橐嫔?xì)胞提供更多的ATP來驅(qū)動(dòng)F0F1－ATPase將質(zhì)子排除細(xì)胞外［30］。將一些生物廢棄物加入到大豆分離蛋白載體中能夠顯著地延緩L.bulgaricusFTDC在模擬胃液中的釋放并加速它們?cè)谀M腸液中的釋放，這是因?yàn)檫@些生物廢棄物中富含耐酸性的膳食纖維素，益生菌細(xì)胞喜好粘附在這些纖維素上面，所以這些生物廢棄物的添加能夠?yàn)橐嫔谀M胃液中提供額外的保護(hù)作用;另一方面，生物廢棄物的添加在一定程度上又能破壞大豆蛋白的交聯(lián)程度，從而導(dǎo)致大豆蛋白在模擬胃液中的溶脹率增加［31－32］。有研究［33］表明某些添加物并不是對(duì)所有包埋于蛋白質(zhì)載體中的益生菌都有效。半胱氨酸鹽酸鹽是一種氧清除劑和氮源，但是儲(chǔ)藏過程中，它提供給包埋細(xì)胞的作用卻隨著菌株的不同而不同。玉米抗性淀粉會(huì)影響蛋白質(zhì)微膠囊的均勻性，從而破壞蛋白質(zhì)基質(zhì)的物理屏障作用，所以玉米抗性淀粉的添加會(huì)使得蛋白質(zhì)微膠囊對(duì)益生菌保護(hù)作用的降低［34］。

4.2 對(duì)蛋白質(zhì)載體進(jìn)行包衣

通過海藻酸鈉的二次包衣能夠有效地減少乳清蛋白基質(zhì)在模擬胃液中的降解;同時(shí)還能降低外界溶劑分子對(duì)蛋白質(zhì)微膠囊的擴(kuò)散速度。相比于單純的蛋白質(zhì)微膠囊，經(jīng)過海藻酸鈉包衣的蛋白質(zhì)微膠囊能夠提高酵母在模擬胃液中60%的存活率，并且，在連續(xù)的模擬胃腸道實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過海藻酸鈉包衣的蛋白質(zhì)微膠囊在1h模擬胃液的處理后能夠在1h內(nèi)將所有包埋的酵母細(xì)胞釋放于模擬腸液中［35］。Annan等［36］比較了不同海藻酸鈉包衣方法對(duì)益生菌在模擬胃液中的保護(hù)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于內(nèi)源包衣方法，外源包衣方法制備得到的微膠囊表現(xiàn)出更為堅(jiān)實(shí)的特性(更難破碎，在連續(xù)的胃腸道實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出更長的崩解時(shí)間)，且提供給菌的保護(hù)效果更好。雖然油脂和蠟是兩種能夠抵御水分子滲透的食品級(jí)包埋壁材，但是有研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚油對(duì)蛋白質(zhì)的二次包衣并不能提高菌在儲(chǔ)藏期內(nèi)的存活率，這可能是因?yàn)樽貦坝桶聦犹《谟椭瑢有纬稍S多裂縫，水分子能夠通過這些裂縫進(jìn)入蛋白質(zhì)基質(zhì)內(nèi)部來影響菌的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，不過這個(gè)問題可以通過向油脂中加入一些塑化劑來解決［37］。

4.3 將蛋白質(zhì)和其它碳水化合物進(jìn)行反應(yīng)

蛋白質(zhì)可以與多種陰離子多糖產(chǎn)生復(fù)合凝聚。通過控制復(fù)凝聚反應(yīng)環(huán)境的pH、離子強(qiáng)度和聚合物濃度，也能實(shí)現(xiàn)對(duì)各種生物活性成分的包埋［38］。Oliveria等［39－40］把益生菌分散到酪蛋白和果膠的混合溶液中之后，調(diào)節(jié)pH到4.8，這時(shí)果膠和酪蛋白形成不溶性的共聚體，然后再經(jīng)過干燥該體系得到包埋有益生菌的果膠/酪蛋白微粒，該微粒能夠提高益生菌的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，但是提供給益生菌對(duì)酸液環(huán)境的保護(hù)效果卻隨著干燥方法的不同而發(fā)生變化，由流化床干燥得到的微粒能夠在酸液中有效地保護(hù)益生菌，而噴霧干燥得到的微粒則不能。蛋白質(zhì)和還原糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物能夠提高益生菌在儲(chǔ)藏期和人體模擬胃腸道中的存活率，這是因?yàn)橥ㄟ^美拉德反應(yīng)，蛋白質(zhì)之間可以形成更多的共價(jià)交聯(lián)［41－42］，而交聯(lián)程度的提高有助于減少有害物質(zhì)的滲透，同時(shí)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有清除氧和降低氧化還原勢(shì)的作用［43］，這將有助于為那些厭氧或微好養(yǎng)的益生菌細(xì)胞提供一個(gè)適宜的儲(chǔ)藏環(huán)境。Guerin等［44］向分散有膠囊的NaCl溶液中加入1000μL的0.1mol/L NaOH，由于環(huán)境pH的提升，膠囊內(nèi)部的果膠和乳清蛋白分子通過轉(zhuǎn)酰氨基反應(yīng)而發(fā)生交聯(lián)，從而使得膠囊外部形成一層致密的外殼，這層外殼能夠有效地提高益生菌對(duì)低酸和高膽鹽環(huán)境的抗性。

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Review of protein and its application in m icroencapsulation of probiotics

LIU Da－yu，ZOU Qiang，WANG W ei*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Chengdu University，Chengdu 610106，China)

Protein was the main ingred ient in food system，which had a lot of excellent physical and chem ical p roperties.Protein could be used in m icroencapsulation of p robiotics，which not only im p rove the survival rate of p robiotic cells in adverse cond itions，but also be used as the vec tor for intestinal delivery of p robiotics.The app lication p rincip le of p rotein in p robiotic m icroencapsulation and its app lication p rogress weremainly reviewed in this manusc rip t.

p roteins;p robiotics;m icroencapsulation

TS201.2

A

1002－0306(2012)12－0409－05

2011－10－18 *通訊聯(lián)系人

劉達(dá)玉(1964－)，男，碩士，教授，研究方向:食品科學(xué)與工程。